疫苗前沿 | 新型脂質實現mRNA癌癥疫苗的高抗原表達和低炎癥反應

文獻題目：Low reactogenicity and high tumour antigen expression from mRNA-LNPs with membrane-destabilizing zwitterionic lipids（具有膜破壞性兩性離子脂質的mRNA-LNP具有低反應原性和高腫瘤抗原表達）

發表期刊：

Nature Biomedical Engineering

研究團隊：康奈爾大學江紹毅教授團隊

主要研究結果：研發出一種膜破壞性兩性離子（MeDZ）可電離脂質，將其整合到脂質納米顆粒（LNP）遞送系統中用于包封mRNA，在生理pH下保持良好生物相容性，在內涵體酸性環境中快速質子化，促進mRNA高效表達；同時顯著降低注射部位炎癥反應和中性粒細胞浸潤，在小鼠黑色素瘤模型中實現腫瘤發生預防、肺轉移抑制、腫瘤生長干預及復發減少，且與免疫檢查點阻斷療法協同增效，為mRNA癌癥疫苗的臨床轉化提供了新方案。

研究背景

當前mRNA癌癥疫苗走向臨床應用的兩大核心障礙尤為突出。其一，是mRNA表達效率有限。mRNA疫苗進入細胞后，大多被內涵體捕獲，難以逃逸到細胞質中發揮作用，而癌癥疫苗對腫瘤抗原的表達量要求更高，需要更高效的內涵體逃逸機制才能滿足治療需求。其二，是不可避免的炎癥反應（反應原性）。脂質納米顆粒（LNP）作為mRNA遞送的關鍵載體，其成分尤其是可電離脂質，容易引發注射部位紅腫、疼痛等局部炎癥。

以上現狀促使研究團隊致力于開發新型遞送系統。

核心內容詳解

（一）MeDZ脂質的設計與LNP合成

研究方法

研究團隊基于兩性離子材料的優良生物相容性和可電離脂質的pH響應特性，設計了MeDZ脂質的獨特結構：采用吡啶基羧酸甜菜堿（PyCB）作為親水頭基，搭配可降解的疏水性多尾烷基鏈和叔胺連接體。合成過程通過化學偶聯反應將各功能結構域連接，經核磁共振（NMR）光譜驗證結構正確性，并通過動態光散射、透射電鏡等技術表征其物理化學性質。

為構建MeDZ LNP，研究團隊改良了商業化BNT162b2 LNP的配方，用MeDZ脂質逐步替換原有ALC-0315可電離脂質，調整摩爾比例從0%到50%，制備系列MeDZ LNP制劑，并對其粒徑、zeta電位、等電點（pI）、mRNA包封效率及細胞毒性進行檢測。

實驗結果

MeDZ脂質的PyCB頭基在生理pH（7.4）下可與水形成氫鍵復合物，呈現兩性離子特性；當pH低于6.8（接近內涵體pH 5.9~6.2）時，快速轉化為帶正電的質子化狀態（PyCB–H?O?），且計算模擬證實該質子化狀態熱力學更穩定。

系列MeDZ LNP制劑的粒徑均在100~120 nm，與BNT162b2 LNP相近，mRNA包封效率均超過80%，細胞毒性可忽略不計。其中，MeDZ（25%）LNP的等電點為6.61，在后續實驗中表現出最佳的mRNA遞送效能。

（二）體外效能評估

研究方法

mRNA 表達效率檢測：將增強型綠色熒光蛋白（EGFP）mRNA封裝于不同比例MeDZ LNP中，與DC2.4細胞共孵育，通過流式細胞術檢測EGFP熒光強度，評估mRNA表達水平。

細胞攝取實驗：采用Cy5標記的mRNA制備LNP，孵育DC2.4細胞后檢測細胞內Cy5熒光強度，分析細胞攝取能力。

內涵體逃逸驗證：通過F?rster共振能量轉移（FRET）實驗評估LNP對內涵體模擬脂質體的破壞能力；利用共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）觀察NBD標記LNP與LysoTracker紅染色內涵體的共定位情況，計算Pearson共定位系數；通過溶血實驗檢測LNP在酸性條件下的膜破壞活性。

抗原呈遞檢測：將卵清蛋白（OVA）mRNA封裝于MeDZ LNP，轉染BMDCs后，通過Western blot檢測OVA蛋白表達量，流式細胞術檢測細胞表面MHC-I分子呈遞的OVA抗原片段（H2Kb-SIINFEKL）水平。

實驗結果

MeDZ（25%）LNP在DC2.4細胞中的EGFP表達效率達到BNT162b2 LNP的 1.7 倍，且細胞攝取能力與BNT162b2 LNP相近，證實其高效表達源于內涵體逃逸效率的提升。

FRET實驗顯示，在pH 6.0條件下，MeDZ LNP對內涵體模擬脂質體的破壞率顯著高于BNT162b2 LNP。

CLSM結果顯示，MeDZ LNP組的NBD熒光與LysoTracker紅熒光共定位系數（0.78）低于BNT162b2 LNP組（0.90），表明更多mRNA逃逸到細胞質中。溶血實驗進一步證實MeDZ LNP在內涵體pH下具有更強的膜破壞活性。

在抗原呈遞實驗中，MeDZ LNP轉染的BMDCs中OVA蛋白表達量顯著高于BNT162b2 LNP組，細胞表面H2Kb-SIINFEKL高表達細胞比例達到16.0%，遠高于BNT162b2 LNP組的9.26%，為后續激發特異性T細胞應答奠定了基礎。

（三）體內遞送與安全性評估

研究方法

體內mRNA表達檢測：將螢火蟲熒光素酶（Luc）mRNA與 DiR標記的MeDZ LNP經皮下注射到C57BL/6小鼠尾基部，6小時后通過IVIS成像系統觀察淋巴結中熒光素酶表達和LNP分布。

細胞靶向性驗證：向Ai14小鼠皮下注射Cre mRNA負載的MeDZ LNP，48小時后收集腹股溝淋巴結，流式細胞術檢測不同免疫細胞中tdTomato陽性細胞比例，明確LNP的靶向細胞類型。

反應原性評估：C57BL/6小鼠皮下注射MeDZ LNP后3天，收集注射部位皮膚組織，通過Luminex技術檢測炎癥細胞因子（GM-CSF、IL-1β、IL-6）水平，流式細胞術分析CD45+細胞中中性粒細胞比例，HE染色觀察組織炎癥病理變化；檢測血清中谷丙轉氨酶（ALT）和谷草轉氨酶（AST）水平評估肝毒性。

低炎癥機制探究：通過Western blot檢測DC2.4細胞中NF-κB通路激活情況，結合RNA測序分析差異表達基因，探究MeDZ LNP低炎癥反應的分子機制。

實驗結果

體內成像結果顯示，MeDZ（25%）LNP在淋巴結中聚集并表現出最高的熒光素酶表達效率，內涵體逃逸效率達到BNT162b2 LNP的1.7倍。

Ai14小鼠實驗證實，MeDZ LNP可高效靶向淋巴結中的抗原呈遞細胞，5.06%的樹突狀細胞和4.57%的巨噬細胞成功表達tdTomato。

安全性評估顯示，MeDZ LNP組注射部位皮膚組織的GM-CSF、IL-1β、IL-6水平僅為BNT162b2 LNP組的 41.8%~65.7%，中性粒細胞浸潤比例顯著降低，皮膚紅腫等炎癥表現明顯減輕；血清ALT和AST水平無顯著升高。

機制研究發現，MeDZ LNP對DC2.4細胞中NF-κB通路的激活作用顯著弱于BNT162b2 LNP，RNA測序顯示其主要激活抗原加工呈遞通路，而炎癥相關通路激活程度溫和。

小結

MeDZ LNP 經皮下注射后可高效靶向淋巴結中的抗原呈遞細胞，在實現 mRNA 高效表達的同時，顯著降低載體的反應原性。

（四）腫瘤防治效能評估

研究方法

預防性實驗：C57BL/6小鼠分別接種PBS、BNT162b2 LNP-OVA mRNA、MeDZ LNP-OVA mRNA，第0天初免，第5、10天加強免疫，第14天檢測血清OVA特異性IgM 和IgG水平；第15天接種B16F10-OVA腫瘤細胞，監測腫瘤生長情況；流式細胞術檢測淋巴結中抗原呈遞水平、血液中OVA特異性CD8+ T細胞比例及脾臟中記憶 T 細胞亞群（TEM、TCM）比例。

肺轉移抑制實驗：小鼠靜脈接種B16F10-OVA腫瘤細胞后，第1、6、11天接種不同疫苗制劑，第20天處死小鼠，觀察肺組織腫瘤結節形成情況并進行HE染色分析。

復發干預實驗：小鼠靜脈接種B16F10-OVA腫瘤細胞并接種MeDZ LNP疫苗后，第30天在左右側分別皮下接種B16F10-OVA和EO771腫瘤細胞，監測兩種腫瘤的生長情況，流式細胞術檢測腫瘤組織中CD8+ T細胞浸潤和OVA特異性T細胞比例。

治療性實驗：小鼠皮下接種B16F10-OVA腫瘤細胞6天后，分別接種不同疫苗制劑，監測腫瘤生長和小鼠存活情況；另設聯合治療組，在疫苗接種當天及后續加強免疫后1天腹腔注射抗PD-1抗體，評估協同治療效果。

實驗結果

預防性實驗中，MeDZ LNP疫苗組小鼠血清OVA特異性IgG水平顯著高于BNT162b2 LNP組，接種腫瘤細胞后全部小鼠無腫瘤生長，而BNT162b2 LNP組4/6只小鼠實現完全應答。

流式細胞術顯示，MeDZ LNP組淋巴結中樹突狀細胞表面H2Kb-SIINFEKL高表達比例達4.97%，血液中OVA特異性CD8+ T細胞比例為2.80%，脾臟中TEM和TCM細胞比例顯著升高。

肺轉移實驗中，PBS組小鼠肺組織出現大量腫瘤結節，BNT162b2 LNP組結節數量顯著減少，而MeDZ LNP組肺組織未觀察到腫瘤結節。

復發干預實驗顯示，MeDZ LNP疫苗可完全抑制B16F10-OVA腫瘤復發（5只小鼠中3只無腫瘤生長），但對非同源EO771腫瘤生長抑制作用微弱，證實其激發的免疫應答具有抗原特異性；腫瘤組織中CD8+ T細胞浸潤比例達40.2%，OVA特異性T細胞比例為5.52%，顯著高于PBS組。

治療性實驗中，MeDZ LNP疫苗組小鼠腫瘤生長顯著抑制，40天存活率達40%，而PBS組和BNT162b2 LNP組存活率均為0；與抗PD-1抗體聯合治療后，6只小鼠中3只實現腫瘤完全抑制，60天存活率提升至50%，顯著優于單獨治療組。

實驗小結

MeDZ LNP疫苗通過高效激發抗原特異性細胞免疫和免疫記憶，實現對腫瘤發生、轉移、復發的全方位防控；在已建立的腫瘤模型中展現出顯著的治療效果，且與免疫檢查點阻斷療法協同增效。

（五）SORT LNP拓展應用

研究方法

研究團隊將其整合到已報道的脾臟靶向 SORT LNP 中，制備SORT MeDZ LNP，以Luc mRNA為報告基因，靜脈注射到C57BL/6小鼠體內，通過IVIS成像系統觀察脾臟中mRNA表達情況；以OVA mRNA為模型抗原，評估SORT MeDZ LNP激發OVA特異性CD8+ T細胞應答的能力；通過溶血實驗驗證其內涵體膜破壞能力。

實驗結果

SORT MeDZ LNP在脾臟中的蓄積未受顯著影響，但mRNA表達效率顯著提升；流式細胞術顯示，SORT MeDZ LNP組小鼠OVA特異性CD8+ T細胞比例達7.43%，高于SORT LNP組（5.32%）和非pH響應性CB脂質構建的SORT CB LNP組（3.42%）；溶血實驗證實SORT MeDZ LNP在內涵體pH下具有更強的膜破壞活性。

小結

MeDZ脂質可與現有靶向遞送系統兼容，通過增強內涵體逃逸效率提升 mRNA 表達和免疫激活效果。

小結

本研究針對 mRNA 癌癥疫苗遞送效率低、反應原性高的核心瓶頸，創新性地設計了膜破壞性兩性離子可電離脂質（MeDZ），構建了高效低毒的 mRNA-LNP 遞送系統。通過 PyCB 頭基的 pH 響應性質子化機制，實現內涵體高效逃逸與 mRNA 高效表達；借助兩性離子結構特性，顯著降低載體反應原性，實現療效與安全性的完美平衡。在小鼠黑色素瘤模型中，該系統展現出全面的腫瘤防治效能，且與免疫檢查點阻斷療法協同增效，同時兼容現有靶向遞送系統，具有廣泛的應用前景。

參考文獻

[1] Zhao Y, Li R, Liu P, Wang J, Cui Y, Ma Y, Cao Z, Cui M, Luozhong S, Wagner E, Laflin A, Ding Y, Hu Y, Tian Z, Tang C, Cai S, Young H, Liu D, Gu W, Bailey S, Jiang S. Low reactogenicity and high tumour antigen expression from mRNA-LNPs with membrane-destabilizing zwitterionic lipids. Nat Biomed Eng. 2025 Dec 18.

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撰寫| RNA星球

校稿| Gddra編審| Hide / Blue sea

編輯 設計| Alice