西湖大學開發相分離遞送技術，重塑多種原代細胞CRISPR基因編輯治療新格局

基因編輯技術CRISPR-Cas9被譽為“分子剪刀”，因其高效、精準和可編程的特性，迅速成為生物醫學研究中的核心工具之一。這項革命性技術不僅極大地推動了基礎生命科學的發展，也為遺傳病、腫瘤等重大疾病的治療提供了全新的策略。在眾多應用方向中，各類功能細胞（尤其是免疫細胞和干細胞）的基因改造尤其受到關注。例如，原代 T 細胞作為適應性免疫系統的關鍵執行者，是開發 CAR-T、TCR-T 等前沿細胞療法的重要載體；NK 細胞憑借其獨特的靶向殺傷機制，成為 CAR-NK 等新型免疫治療的熱點對象；而干細胞的基因編輯更是在再生醫學與多種難治性疾病的治療中展現出廣闊前景。對這類原代細胞進行精準高效的基因編輯，已成為生物醫學研究及臨床轉化的重要前沿。

然而，盡管 CRISPR-Cas9 系統本身具備強大的編輯能力，其在原代免疫細胞和干細胞中的實際應用仍面臨嚴峻挑戰。這些細胞來源于人體外周血、組織或特定分化階段，具有高度的生理敏感性和有限的體外擴增能力。它們對環境變化極為敏感，容易發生凋亡、分化或功能耗竭，且細胞膜結構往往致密，對外源大分子物質的攝入效率極低。這些共性生物學特性使得將 CRISPR 組件高效、安全地遞送進細胞內部成為制約基因編輯成功的關鍵瓶頸。

目前常用的遞送方法在各類原代細胞中各有局限。脂質體或陽離子聚合物等化學轉染試劑在易轉染細胞系中可能表現良好，但在原代 T 細胞、NK 細胞或干細胞中往往效率低下且細胞毒性顯著；電穿孔技術雖能提高外源物質的導入率，但強烈的電流脈沖會對細胞膜和細胞穩態造成不可逆損傷，導致細胞存活率大幅下降、分化異常或功能喪失，嚴重影響后續研究與治療應用；病毒載體雖然轉導效率較高，卻存在插入突變風險、免疫原性反應以及生產復雜、成本高等問題，在干細胞編輯中尤其需考慮其長期安全性，因此在臨床前研究中仍限制較多。

因此，如何在不損害細胞活力的前提下，實現 CRISPR 基因編輯組件的高效遞送，已成為提升基因編輯效率和臨床應用可行性的核心難題。理想的遞送系統應兼具高轉染效率、低細胞毒性、良好的細胞功能維持以及臨床轉化潛力，才能滿足從基礎科研到治療開發的多元需求。

一、CRISPR-Cas9工作機制：精準的基因“剪刀”

CRISPR-Cas9 系統的發現源于對細菌免疫機制的研究。自然界中，細菌和古菌為抵御噬菌體等外來遺傳物質的入侵，演化出一套基于 CRISPR 序列的記憶性防御系統。經過科學改造，這一系統已被轉化為一種強大而靈活的基因編輯工具，廣泛應用于基因敲除、插入、調控等多種操作。

關鍵組分：

• Cas9 蛋白：一種核酸內切酶，負責切割 DNA 雙鏈。

• sgRNA（單鏈向導RNA）：引導 Cas9 蛋白靶向特定基因序列。

編輯過程：

• 靶向定位：sgRNA 通過堿基互補配對，結合到目標 DNA 序列。

• DNA 切割：Cas9 在 sgRNA 引導下切割 DNA，形成雙鏈斷裂（DSB）。

• DNA 修復：細胞通過非同源末端連接（NHEJ）或同源定向修復（HDR）修復斷裂，從而實現基因敲除或插入。

CRISPR-Cas9 系統的優勢在于其高度的可編程性和靶向特異性，只需更換 sgRNA 序列即可靶向不同基因，極大提升了實驗的靈活性與效率。然而，無論編輯設計多么精巧，若無法將其有效遞送至目標細胞內部，尤其是像原代免疫細胞及干細胞這類“難轉染”細胞，再先進的編輯策略也難以發揮其應有作用。

二、ProteanFect?遞送Cas9基因編輯系統——原代免疫細胞、干細胞等基因編輯新策略

為突破原代免疫細胞、干細胞等難轉染細胞的基因編輯中的遞送瓶頸，西湖凝聚體與西湖大學聯合開發了 ProteanFect?CRISPRMax Ultra 轉染試劑盒。該系統基于創新的生物分子凝聚體技術，專為高效遞送 RNP 復合物/Cas9 mRNA-sgRNA 復合物至難轉染的原代細胞（原代 T 細胞、B 細胞、NK 細胞、干細胞等）而設計，展現出卓越的轉染效率與細胞兼容性，為免疫學與細胞治療研究提供了強有力的技術支持。

與傳統遞送方式不同，ProteanFect?不依賴脂質包裹或電穿孔等物理化學手段，而是模擬細胞內天然的相分離現象，利用功能性內源蛋白與 CRISPR-Cas9 基因編輯系統自發組裝形成動態的生物分子凝聚體。這種凝聚體結構能夠溫和地攜帶 RNP 復合物/Cas9 mRNA-sgRNA 復合物，通過細胞的內吞途徑進入胞內，避免了劇烈處理對細胞造成的應激損傷。

ProteanFect?遞送系統實現基因編輯的分子機制如下（圖1）：

• 凝聚體組裝：RNP/Cas9 mRNA-sgRNA 與 ProteanFect?內源蛋白一起組裝成為凝聚體復合物；

• 細胞攝取：凝聚體通過胞吞吸收，遞送進入細胞內；

• 胞內釋放與轉運：復合物釋放并進入細胞核與靶 DNA 結合；

• 靶向編輯：精準切割靶基因，實現高效基因編輯。

圖1. ProteanFect?RNP-based CRISPR及mRNA-based CRISPR遞送原理

這一遞送策略有效規避了電穿孔帶來的高細胞死亡率和病毒載體潛在的安全風險，同時在編輯效率上優于傳統化學試劑的轉染方法。更重要的是，使用 ProteanFect?處理后的原代細胞通常保持較高的存活率和功能完整性，有利于后續的功能驗證、擴增或回輸實驗。該系統的操作極為簡便，無需復雜的設備或繁瑣的預處理步驟。

ProteanFect?CRISPRMax Ultra的出現，標志著原代免疫細胞基因編輯正從“高難度操作”向“標準化流程”轉變。它不僅提升了實驗的可重復性與成功率，也為大規模篩選、多基因編輯以及臨床前研究提供了可靠的技術平臺。

三、ProteanFect?CRISPRMax Ultra高效基因編輯各種原代細胞成功案例

1. 小鼠原代 T 細胞

利用ProteanFect?CRISPRMax Ultra 小鼠免疫細胞轉染試劑盒（貨號：PT09）對小鼠原代 T 細胞進行基因編輯：采用 Trac sgRNA/Cas9 蛋白（RNP）轉染的方案，結果如下圖 2 所示。基因組水平檢測（圖2左）顯示小鼠T細胞整體 DNA 突變率達 84.3%，蛋白水平檢測（圖2右）顯示蛋白敲低效率達 86.3%。

圖2. 使用ProteanFect?CRISPRMax Ultra小鼠免疫細胞轉染試劑盒對小鼠原代T細胞進行基因編輯

2. 人原代 T 細胞

利用ProteanFect?CRISPRMax Ultra 轉染試劑盒（貨號：PT08）對人原代 T 細胞進行基因編輯：采用 TRAC sgRNA/Cas9 蛋白（RNP）轉染的方案，結果如下圖 3 所示。基因組水平檢測（圖2左）顯示人 T 細胞整體 TRAC 突變率達 80.1%，蛋白水平檢測（圖2右）顯示蛋白敲低效率達 85%。

圖3. 使用ProteanFect?CRISPRMax Ultra轉染試劑盒對人原代T細胞進行基因編輯

3.iPSC 誘導多能干細胞

來自斯坦福大學的研究團隊利用 ProteanFect?成功遞送 PE7 基因編輯系統至 PBMC 來源的 iPSC，并實現精準點突變（c.757G>T），堿基替換效率達 55%，進一步驗證了該試劑在難轉染干細胞中的高效基因編輯能力（圖4）。

圖4. 使用ProteanFect?遞送PE7系統進入iPSC進行基因編輯

四、邁向高效與溫和的基因編輯新時代

隨著精準醫學和細胞治療的快速發展，對多種功能細胞進行高效基因編輯的需求正持續增長。無論是免疫細胞（例如 T 細胞、NK 細胞、巨噬細胞）還是多能干細胞或造血干細胞，其在疾病建模、再生醫學和新型細胞療法開發中都占據核心地位。而像 ProteanFect?這樣的創新遞送技術，正在為這一廣闊領域注入新的活力。它不僅是一項技術進步，更代表了一種研究范式的轉變——使我們能夠以更溫和、更高效的方式與細胞“對話”，在最大程度保持細胞功能與狀態的前提下，實現對基因組的精準調控。

未來已來，基因編輯的大門正因這些關鍵而細膩的技術突破越開越大。對于每一位致力于免疫治療、基因工程與再生醫學的研究者而言，掌握一類高效、安全且適用于多種難編輯細胞類型的遞送工具，或許正是邁向下一代生物醫學發現與臨床轉化的第一步。

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西湖凝聚體生物是專注于核酸遞送領域的國家級高新技術企業，已服務國內外大量頂尖高校及科研機構。我們成功研發了全球首個基于哺乳動物內源蛋白的凝聚體核酸遞送平臺，為高效基因遞送提供了創新解決方案。

我們的首個產品 ProteanFect?轉染試劑系列，顯著提升了原代細胞和難轉染細胞系的基因遞送效率，助力全球科研工作者更高效便捷地開展基因研究。同時，我們正與全球藥企和生物技術公司緊密合作，開發一系列前沿基因治療臨床產品。歡迎全球研究者和合作伙伴與我們攜手，共同推進更創新、更高性能的基因遞送系統和產品的開發。

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