CAR-T細胞制造流程：過程控制與質量控制檢測

所有臨床級CAR-T細胞均在現行藥品生產質量管理規范（cGMP）條件下，經過嚴格的質量控制（QC）檢測后制造和放行。迄今為止，生產主要在集中化設施中進行（如市場授權產品），但在去中心化的護理點（PoC）設施（針對多種研究性產品）進行生產也逐漸興起。在后一種模式下，制造位于臨床中心，以便于及時給藥和提高物流效率。

盡管個體化CAR-T產品的制造流程存在產品特異性差異，但其總體工作流程是統一的。作為起始材料，根據人類來源物質（SoHO）法規，獲取新鮮或冷凍保存的白細胞分離產物。隨后所有對分離產物的操作必須在符合GMP的環境中進行，這是先進治療醫藥產品（ATMP）法規的要求。這包括在適用時，分離和純化T細胞（例如CD3+、CD4+和/或CD8+亞群），作為制造過程中的中間產物。

此中間材料也可進行冷凍保存或作為新鮮材料用于后續制造步驟，這些步驟通常包括T細胞激活、轉導和擴增。對于激活，通常通過多效性細胞因子（主要是IL-2、IL-7和/或IL-15）結合可溶性抗體或抗體包被微珠提供的抗CD3/CD28刺激來刺激T細胞。為了利用CAR對T細胞進行基因修飾，可以使用病毒平臺（例如慢病毒或逆轉錄病毒）或非病毒平臺（例如轉座子）。

此外，在某些情況下，會實施基因編輯，例如降低耗竭標志物或同種異體反應性抗原的表達。然后，修飾后的T細胞被擴增至達到所需劑量，通常需要5至14天，盡管某些新方法可將培養期限制在短短幾個小時（24-48小時）。

在整個制造過程中，會進行各種過程控制（IPC）和QC測試，以確保最終藥物產品（DP）的純度、安全性和效力（表1）。DP可以以新鮮或冷凍保存的制劑形式給予患者。冷凍保存的DP具有較長的保質期（以年計），為完成放行所需的QC檢測以及管理患者最佳治療窗口提供了更大的靈活性。

新鮮CAR-T細胞DP通常必須在制造完成后1-2天內給予患者，這對在輸注前及時完成所有QC檢測提出了挑戰。這對于無菌檢測尤其相關，因為根據藥典標準，無菌檢測需要至少七天的培養期。為了解決這一限制，新鮮CAR-T細胞輸注通常采用兩步放行策略。這包括初步有條件放行證書，允許基于短時間內可獲得的關鍵QC參數進行輸注，隨后在所有強制性檢測（包括生物安全性檢測）完成后，簽發最終放行證書。

表1.在不同CAR-T細胞制造步驟中執行的IPC和放行QC檢測

IPC與QC檢測

為確保純度、有效性、安全性和批次一致性，CAR-T細胞DP需經過嚴格的QC檢測。CAR-T細胞DP的質量不僅在最終收獲和制劑后為產品放行進行評估，也在整個制造過程中的關鍵步驟進行評估。此類IPC檢測對于早期發現和潛在糾正偏差至關重要，從而最大限度地降低風險并確保最終DP符合預定的質量屬性。必要的IPC檢測包括但不限于：在離體培養開始時和T細胞分選后，通過流式細胞術分析確定細胞活力、T細胞純度和細胞計數。此外，在T細胞轉導步驟后幾天，會測定CAR-T細胞的百分比（表1）。

關于QC放行檢測，這些檢測通常在最終DP上進行。然而，如果提供了適當的理由，放行檢測可以在更早的階段對藥物物質進行。對于所有DP的QC放行檢測（表2），需要定義合理設定的可接受標準，以確保安全性、質量與一致性。

根據藥典指南，每個CAR-T細胞批次必須進行含量（細胞組成）、鑒別（CAR表達）和純度（（CAR）T細胞百分比）檢測。此外，必須進行無菌性、支原體和內毒素檢測以確保產品安全。在產品開發過程中，需要對藥物產品的生物活性進行進一步表征，以建立相關的效價測定方法。該測定應反映CAR-T細胞的作用機制（MoA），即抗原特異性觸發CAR后T細胞的激活。由于可接受標準通常基于臨床評估開始時有限的DP生產批次，其性質本質上是初步的，應在進一步開發過程中審查和調整。

在特定情況下，例如自體新鮮CAR-T產品，完整的放行檢測可能在患者給藥前無法完成。在此類情況下，必須實施基于風險的方法，以證明在輸注前使用一組更為有限的可用檢測結果是合理的，完整的QC檢測結果在治療后獲得。雖然合格方法在早期開發階段是可接受的，但到II期結束時以及注冊試驗階段需要完全驗證的分析方法（圖1）。這一要求與確保產品可比性的需求密切相關，例如在不同制造場地之間。這不僅對于證明授權CAR-T細胞產品全球供應的一致性至關重要，而且在為PoC策略啟動多個制造中心的情況下也相關。由于起始材料、設備和操作人員專業知識的差異很大——這些因素都可能影響產品質量屬性和批次間一致性——實施可比性研究面臨著重大挑戰。

表2.QC放行檢測總結及對應的歐洲藥典（EP）章節和歐盟指南，這些是分析方法開發所必需的

圖1.CAR-T細胞DP從早期開發到市場授權所需的方法驗證要求

效價測定

如上所述，CAR-T細胞DP的放行嚴格依賴于對特定定性和/或定量特性的評估，這些特性被稱為關鍵質量屬性（CQA），并參照預定的可接受標準進行評估。其中，效價是一個關鍵屬性，根據美國食品藥品監督管理局（FDA）和歐洲藥品管理局（EMA）的指南，必須作為每個CAR-T細胞批次放行所需的QC檢測的一部分進行評估。

根據ICH Q6B，效價被定義為對DP生物活性的度量，通過與其相關生物學特性及產品所聲稱的MoA相關聯的定量測定進行評估。值得注意的是，并不要求開發與患者預后具有預測相關性的測定方法。因此，效價應僅被視為一個放行規格。在CAR-T細胞的背景下，效價測定旨在測試CAR-T細胞批次識別和消除腫瘤細胞的功能質量，例如通過測量與表達靶抗原的腫瘤細胞共培養后細胞因子的釋放（主要是IFN-γ）、T細胞增殖或抗腫瘤細胞毒性。

CAR-T細胞MoA的高度復雜性和錯綜性使得難以定義一種能夠完全代表其潛在生物活性的單一測定方法。事實上，FDA和EMA建議在初始臨床階段盡早建立多種潛在的效價測定方法，以便最終確定并驗證用于關鍵試驗的最佳效價測試。此外，FDA建議在產品放行時使用多種測定（即所謂的矩陣測定方法）來測量效價的不同方面，包括（1）細胞活力，（2）載體轉導效率，（3）CAR表達，（4）細胞毒性和（5）細胞因子產生。

盡管每種效價測定都有其特定的特點，但目前尚無一種適用于所有不同CAR-T細胞產品的通用解決方案，能夠支持在所有情況下優先選擇某一種方法。最佳測定方法的識別與開發需要應對幾個關鍵挑戰，包括：1）放行檢測的時間限制（例如，對于新鮮DP），2）可用于測試的實驗材料有限（例如，制造時間非常短的CAR-T制造），3）商業化的全球可用參考標準和對照品有限，4）不同中心之間的差異性。最后，效價測定代表了一項CQA，它作為病毒載體鑒定、DP穩定性評估以及制造中心間可比性研究的基礎——無論是遵循集中式還是分散式生產模式。

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