ADC關鍵質量屬性的分析方法

引言

分析方法是抗體藥物偶聯物開發用于臨床試驗和商業化的關鍵組成部分。各種分析方法已被用于產品表征、放行和穩定性測試，以及藥代動力學和藥效學研究。由于單克隆抗體的復雜性質，ADC的表征在很大程度上基于用于mAb的方法，此外還包括控制藥物載量比和分布以及藥物相關雜質的方法。ADC的分析方法開發應在非臨床和臨床研究開始前就啟動，然后在ADC開發生命周期中進行優化，并在商業化前完成全面驗證。

與mAb相比，ADC由于偶聯的異質性，即藥物抗體比、藥物載量分布、位置異構體以及未偶聯抗體和游離藥物等額外產品變異體的存在，其復雜性水平增加。因此，為ADC選擇的方法應適合其預期目的，如放行和穩定性或產品表征，并應考慮臨床開發階段和ADC的性質。本文將聚焦于為ADC設計的分析方法，重點關注其特殊考慮和挑戰，特別是用于放行、穩定性和表征的方法以及產品屬性。

一、藥物抗體比與藥物載量分布的測定

藥物載量的表征包括測量平均DAR、藥物載量分布、藥物載量變異體和位置異構體的分析方法。DAR是ADC表征、放行和穩定性測試中的關鍵質量屬性之一。它測量與mAb共價結合的細胞毒性藥物的平均數量。在一定范圍內，DAR通常與ADC的效力相關。高水平的DAR通常與細胞毒性水平的增加相關。

1 藥物抗體比的測定

DAR的測定依賴于多種分析方法，包括紫外分光光度法、電噴霧電離質譜、疏水相互作用色譜和反相高效液相色譜。用于放行和穩定性測試的DAR測定方法取決于藥物-連接子的物理化學性質以及mAb與藥物-連接子之間的偶聯化學，例如賴氨酸側鏈的胺基、鏈間二硫鍵還原后的半胱氨酸巰基或mAb中特定位點的工程化半胱氨酸殘基。

疏水相互作用色譜：對于通過硫醚鍵偶聯到mAb半胱氨酸殘基的藥物，DAR通常使用HIC測定。DAR是根據HIC色譜圖中每個偶聯變異體的相對豐度，為ADC樣品中的每個偶聯物種計算得出的。

紫外分光光度法：對于通過抗體賴氨酸殘基偶聯的藥物，DAR通常使用紫外光譜法測定。使用該方法時，DAR是基于在相應波長下測量的藥物-連接子和抗體的峰值吸光度值及其消光系數計算的。然而，該方法有其局限性，例如缺乏特異性，因為它基于游離抗體和游離藥物的水平非常低，因此測量的總抗體和藥物-連接子與偶聯抗體和藥物-連接子的值沒有顯著差異的假設。該方法還要求ADC樣品純凈，沒有在抗體和藥物-連接子吸收波長處也吸收的干擾組分；并且抗體和藥物-連接子的峰值吸光度要充分分離。

質譜法：通過天然MS分析獲得的藥物載量分布可用于通過計算每個抗體和藥物-連接子積分峰的加權峰面積并將所有觀察到的物種的加權峰百分比相加來獲得平均DAR。該方法作為批放行和穩定性測試的應用較少。

2 藥物載量分布

即使對于包含相同平均DAR的ADC，藥物在mAb上的分布也可能不同。研究表明，不同的藥物載量物種在體內可能具有不同的清除率。然而，對于給定的DAR，不同的藥物載量分布是否會有不同的活性，從而影響臨床療效和安全性，目前尚未有文獻記載。

已使用多種方法來表征藥物分布，即HIC、LC-MS、RP-HPLC、IEF等。藥物載量分布通常用作產品表征工具。由于沒有數據證明具有特定DAR的藥物分布是否會對臨床安全性和有效性產生任何影響，建議在產品放行和穩定性時進行該測試。該測試對于評估制造變更以進行ADC質量可比性非常有用。

賴氨酸偶聯的ADCs：對于通過抗體賴氨酸殘基側鏈的胺偶聯的藥物，通常使用LC-MS分析來確定藥物分布和未偶聯抗體的水平。分析ADC樣品的制備過程需要在非變性天然條件下進行。結果顯示，每個抗體含有零到幾個藥物分子的藥物載量物種的混合物。如果可以獲得一系列DAR的ADC樣品，可以進行分析以確定平均DAR與游離抗體含量之間是否存在相關性。

半胱氨酸偶聯的ADCs：目前藥物開發領域的大多數ADC屬于通過部分還原現有的四個抗體鏈間二硫鍵，然后使產生的游離巰基與藥物-連接子反應，形成藥物-連接子與抗體通過硫醚鍵共價連接的半胱氨酸偶聯ADC家族。對于這類半胱氨酸偶聯的ADC，由于存在共價和非共價結合的輕鏈和重鏈的混合物，所有完整分析都必須在天然條件下進行以維持重鏈和輕鏈IgG鏈的非共價結合，因此存在分析挑戰。因此，ADCs不能通過LC-MS方法輕易分析，因為該方法通常使用苛刻的溶劑條件，這會破壞抗體輕鏈和重鏈之間的一些非共價結合。盡管優化的LC-MS方法可用于分析藥物分布，但分析HIC更常用于解析和定量含有不同量偶聯藥物-連接子的半胱氨酸偶聯ADC的分布。該方法利用了藥物-連接子附著在半胱氨酸殘基上賦予ADC的增強的疏水特性。使用非變性和相對溫和的條件實現分離，這保留了由共價和非共價結合組合保持在一起的各種藥物載量變異體的抗體亞基。DAR是為每個藥物載量變異體確定的。溶液中存在的加權平均DAR可以根據單獨解析的MR變異體的相對豐度計算得出。通過使用此方法，解析出藥物載量變異體的分布范圍從每抗體0到8個藥物。由于一個還原的二硫鍵產生兩個硫醇基團，偶數藥物載量的變異體更豐富，盡管也觀察到含有奇數藥物-連接子的藥物載量變異體。如果偶聯反應設計良好且受控，也可以定量未偶聯抗體，并且通常以低水平存在。

二、ADC濃度

ADC濃度是通過測量ADC溶液在特定紫外波長下的吸光度，然后使用ADC的摩爾吸光系數計算其濃度來確定的。ADC的摩爾吸光系數是mAb和藥物-連接子的總和，可以通過紫外光譜儀實驗確定。抗體的摩爾吸光系數可以從理論值獲得，并應通過實驗確認。ADC的理論比吸光度常數是通過將其摩爾吸光系數除以抗體的平均分子量來建立的。使用此比吸光度常數確定的濃度僅反映ADC的蛋白質組分（即mg/mL蛋白質），不包括偶聯的藥物-連接子的質量。該測試是確定ADC藥物產品效力的分析方法，用于計算給患者施用的臨床劑量。該測試在放行和穩定性時進行。

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三、藥物相關雜質

藥物相關雜質由游離藥物、游離藥物-連接子和淬滅的藥物-連接子組成。RP-HPLC用于定量ADC中存在的游離藥物相關物質的量。ADC樣品用有機溶劑提取，該溶劑沉淀裸露的和藥物偶聯的抗體。含有未偶聯藥物相關物種的上清液使用對藥物-連接子特異的波長通過RP-HPLC進行分析。對應于藥物相關物質的峰使用針對該雜質特異性的參考標準進行定量。游離藥物相關物種的濃度表示為總藥物含量（游離與結合加游離）的百分比。總藥物含量是通過未進行溶劑提取或沉淀的原始ADC樣品的紫外光譜法確定的。該測試在ADC放行和穩定性時進行。ADC中的藥物相關雜質應通過非臨床研究進行限定；然而，有時臨床批次中的水平是通過可用的安全性數據來證明其合理性的。

RP-HPLC方法廣泛用于小分子活性藥物成分的分析，因為該方法成熟，并為分析（含量）和雜質提供了優異的峰形、特異性、重復性、分辨率和物料平衡。為ADC中的藥物-連接子物質開發RP-HPLC方法具有獨特的挑戰，因為藥物-連接子可能在樣品制備過程中或在HPLC分析的水性流動相中降解。這可能導致色譜圖中出現偽峰，并導致誤導性的雜質含量結果。因此，RP-HPLC方法開發通常側重于優化樣品制備和流動相以穩定藥物-連接子并最小化降解。當分析反應性藥物-連接子中間體時，關鍵色譜條件是在各種條件下（如pH和溫度）對藥物-連接子反應的化學動力學進行研究后優化的。反應速率用于指導選擇最佳稀釋劑、流動相、pH和柱溫以最小化柱上降解。該測試應開發為穩定性指示方法，應在放行和穩定性時進行。

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四、抗原結合活性

監測抗原結合的分析方法對于確保產品的效力至關重要。該分析還有助于評估偶聯過程或藥物分子本身是否影響抗原結合。藥物，根據其位置和偶聯化學，可能影響抗原結合。一項研究評估了藥物載量對同一抗CD22 mAb上偶聯的DM1和半胱氨酸偶聯的MMAF的抗原結合的影響。該研究表明，DM1偶聯會干擾抗原結合，并估計每個mAb一到四個DM1分子足以對抗原結合產生負面影響。

如果足夠量的抗原可以以重組形式獲得，并且抗原被抗體識別的方式與細胞上表達的抗原相似，則通常選擇ELISA分析。甚至可以使用細胞的純化蛋白質部分，而不是純化的抗原，盡管此類分析需要額外的對照并且可能難以標準化。在ELISA分析中，通常將抗原或其一部分固定，mAb或ADC在溶液中使用。可以使用標記有過氧化物酶或堿性磷酸酶的抗Ig二抗檢測結合產物。ELISA只能提供相對結合。相比之下，基于表面等離子體共振（SPR）的方法可以產生實際的親和力。SPR的缺點是需要特殊的儀器和專業知識，并且方法優化可能具有挑戰性。例如，極慢的解離可能難以測量，因此無法確定解離速率。在這種情況下，仍然可以通過繪制平衡結合水平與分析物濃度的關系圖，使用穩態分析來估計親和力（KD）。此外，相互作用過程中的構象變化，一個相對常見的現象，將需要使用雙態擬合模型而不是1:1擬合來獲得KD，這帶來了其自身的挑戰。重要的是要記住，使用SPR，只有當使用單價蛋白質（通常是抗原）在溶液中時才能確定KD，因為使用完整mAb在溶液中的不適當分析設計仍然被發表。

如果抗原不能以純化形式獲得，細胞結合分析可能是一種選擇。需要表達內源性或轉染抗原的合適細胞。此外，ADC對細胞的非特異性結合必須很低。由于許多ADC靶向的抗原設計為在結合后迅速內化，因此必須通過減少孵育時間、使用固定細胞和/或在0-4°C下進行分析來最小化抗原-ADC復合物的內化。細胞結合分析可以設置為板式格式，在這種情況下，檢測通常類似于ELISA分析，通常作為直接結合分析。或者，可以使用流式細胞儀和熒光標記的二抗進行細胞結合分析。在任何這些情況下，重要的是評估濃度依賴性的ADC結合以估計樣品的相對親和力。

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五、細胞毒性分析

ADC的預期作用機制是抗原特異性的、藥物依賴性的細胞毒性。因此，使用表達抗原的細胞進行的體外細胞毒性分析是用于放行和穩定性研究中的關鍵效力分析。細胞增殖和活力分析是評估細胞毒性的首選方法。

細胞增殖可以通過直接計數活細胞來評估，或者更方便地通過間接估計細胞增殖來評估。間接分析使用在S期活躍復制的細胞中摻入的核苷類似物，包括放射性胸苷或5-溴-2'-脫氧尿苷。不增殖但存活的細胞在這些分析中檢測不到。盡管細胞增殖分析非常敏感和定量，但作為放行或穩定性分析實施具有挑戰性。

細胞活力分析主要有兩種類型。第一種分析類型是陽性檢測凋亡細胞。細胞可以用碘化丙啶和熒光標記的膜聯蛋白共染色，并通過流式細胞術檢測各種細胞群。碘化丙啶被晚期凋亡和壞死細胞攝取，而膜聯蛋白V與早期凋亡以及晚期凋亡和壞死細胞上存在的膜磷脂酰絲氨酸結合。也可以通過檢測caspase 3和7的活性來識別凋亡細胞。例如，Caspase-Glo? 3/7分析是一種發光分析，測量裂解細胞中的caspase 3/7活性。凋亡分析具有信息量，但需要在優化的精確時間點進行測試。此外，由于低濃度的ADC可能不會有效誘導凋亡，敏感性可能會降低。這些分析在表征研究中很有用，但作為放行或穩定性分析使用面臨重大挑戰。

第二種類型的分析基于區分活細胞和死細胞的代謝標志物間接測量活力。這些標志物包括細胞內ATP、乳酸脫氫酶（LDH）、NADH、蛋白水解酶和氧化還原環境。分析中獲得的信號與活細胞數量成正比。此類分析可以敏感并提供寬動態范圍，因此被廣泛使用。應該考慮的是，一些代謝標志物可能受到刺激或分析條件的調節，可能不純粹反映細胞數量的變化。活細胞中四唑鹽的還原，結合比色檢測，被廣泛用于測量活細胞數量。ADC分析中使用的四唑鹽包括MTT、MTS和WST-8。Resazurin是另一種氧化還原敏感染料，以各種商品名提供，具有低毒性并允許更長的孵育時間，因此經常使用。CellTiter-Fluor?試劑盒也用于細胞毒性分析，使用被活細胞中特定蛋白酶轉化為熒光產物的肽底物。

到目前為止討論的分析方法在單個時間點評估細胞毒性。正在開發提供實時動力學測量的新技術。此類分析提供了獨特的優勢，因為可以評估ADC細胞毒性作用的時間過程。Essen BioSciences提供基于標記的動力學增殖分析IncuCyte ZOOM，它使用自動化顯微鏡成像基于面積（匯合度）測量細胞生長。同一平臺同時使用熒光caspase 3/7試劑評估凋亡。Roche Applied Science的xCELLigence技術測量細胞對印刷在板上的金電極陣列的粘附。這兩種技術都是無標記的，能夠檢測細胞形態，但目前僅限于貼壁細胞。我們尚未知悉任何用于ADC測試的已發表研究。

由于細胞毒性分析被用作主要的效力分析，它們應足夠準確以確保跨不同藥物產品批次的正確患者給藥。此外，效力分析的批放行驗收標準應足夠嚴格，以確保患者不會因引入效力超出預期的批次而用藥過量。對于ADC，由于其潛在的毒性，劑量遞增通常以小步長執行。例如，如果臨床劑量遞增計劃以兩倍步長推進，50-150%的相對效力分析規格，對應于三倍范圍，可能不夠嚴格。如果由于分析限制無法收緊規格，則可能需要限制在臨床研究中使用更多批次。

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六、Fc依賴性效應功能分析

盡管對于ADC，藥物組分引起的細胞毒性是預期的初級作用機制，但額外的機制可能有助于其效力。mAb的同種型具有重要意義，因為對于能夠參與Fc依賴性效應功能的同種型，這些活性可能是體內作用機制的一部分。特別是IgG1抗體能夠結合Fcγ受體和C1q，因此可能參與ADCC、ADCP和CDC等效應機制。因此，評估mAb組分是否具有參與Fc相關效應機制的能力非常重要。事實上，據報道，幾種ADC具有額外的作用機制。Trastuzumab-DM1保留了抗HER2 mAb曲妥珠單抗的所有作用機制，包括ADCC、抑制細胞增殖和抑制HER2脫落。另一種靶向CD37的DM1偶聯ADC顯示出強效的ADCC、ADCP和CDC活性，其中ADCC被證明與親本mAb相當。另一方面，一種為減少Fcγ-受體結合而工程化的抗CD70 IgG1 ADC在小鼠腫瘤模型中出人意料地改善了療效，可能是由于藥代動力學增強所致。

監測Fc依賴性效應功能的分析可以是基于細胞的或無細胞的。基于細胞的分析執行方式與ADC和mAb類似，盡管對于ADC需要額外的對照來證明靶細胞毒性與藥物無關。傳統的ADCC分析使用原代NK細胞或PBMC作為效應細胞，而新穎的分析使用能夠進行高效FcγRIII依賴性殺傷的人NK細胞系。使用NK細胞系具有顯著優勢，即減少了使用原代細胞進行的ADCC分析中眾所周知的巨大變異性。在這兩種類型的ADCC分析中，抗原陽性靶細胞用一系列濃度的mAb或ADC包被，孵育數小時后測量靶細胞裂解。細胞裂解可以通過測量細胞內標記物或標志物的釋放來定量，包括鉻51、resazurin染料和LDH。CDC分析使用與ADCC分析相似的靶細胞和檢測方法，并添加人或動物血清作為補體來源。盡管ADCP可能有助于許多mAb的作用機制，但由于開發足夠特異性和敏感的吞噬作用分析的困難，這種潛力很少被評估。使用原代單核細胞衍生的巨噬細胞作為效應細胞，通過流式細胞術檢測記錄靶細胞和效應細胞的雙陽性事件，已顯示了一種ADC的ADCP活性。

無細胞分析基于測量mAb與Fcγ受體或C1q的直接結合。分析可以基于ELISA或SPR格式，并且與ADC和mAb的執行方式相同。ELISA通常用于測量C1q結合。一項已發表的分析涉及將一系列濃度的mAb樣品固定，并使用HRP標記的抗C1q抗體測量可溶性C1q結合。最近發表了一項測量C1q結合的SPR分析。相比之下，Fcγ-受體結合通常使用SPR進行評估。mAb或Fcγ受體直接固定或捕獲在傳感器上，另一個分子在溶液中使用。大多數Fcγ受體與IgG結合具有快速動力學，對于此類相互作用，通常使用穩態分析來估計KD。

這些分析作為表征研究的一部分進行，使用未偶聯的mAb、ADC或理想情況下兩者，在這種情況下可以評估藥物偶聯的影響。mAb應表征其Fc相關效應功能。如果認為ADC具有多種作用機制，則可能需要執行額外的效力分析，作為mAb中間體和/或藥物物質和藥物產品放行測試的一部分。如果mAb被工程化以減少效應功能，則應在表征期間證明這一點。在開發早期，這些研究是為了在關鍵臨床研究時更好地理解作用機制而進行的。

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七、免疫原性分析

ADC中使用的藥物通常太小，無法自行引發免疫反應。然而，當偶聯到載體蛋白如mAb上時，小分子可以觸發免疫反應。ADC的另一個考慮是，疏水性藥物可以增加其形成聚集物的能力，從而增加ADC引發免疫反應的可能性。ADC可能引發針對mAb、連接子或藥物部分上存在的表位，或在兩個組分界面處形成的新表位的免疫反應。盡管近年來沒有報道因對mAb的免疫反應而導致的嚴重不良事件，但抗產品抗體可能對PK產生不利影響并降低療效。對于ADC，在免疫復合物形成時，另一個擔憂是將毒性藥物遞送到體內意外位置。在兩種目前上市的ADC中，據報道brentuximab vedotin在美國處方信息中在7%的患者中引發持續性APA，而30%的患者被發現短暫陽性。在所有患者中，免疫反應均針對嵌合mAb組分。在62%的APA陽性患者中檢測到中和抗體。兩名（1%）具有持續性APA反應的患者因輸注反應而停止治療。在trastuzumab emtansine的情況下，據報道5.3%的患者APA陽性，而未測試中和APA。值得注意的是，trastuzumab emtansine報告的免疫原性率比接受trastuzumab治療的患者發現的免疫原性高幾倍，這表明ADC可能比mAb更具免疫原性。

ADC免疫原性測試中使用的方法與用于mAb的方法相似。檢測結合抗體的抗體具有挑戰性，因為沒有試劑可以與抗體和抗抗體交叉反應。解決此問題的常見方法是橋接ELISA或電化學發光分析，其中一個APA分子連接兩個產品分子，一個用于固定，另一個用于檢測復合物。進一步偶聯ADC以生成標記試劑可能帶來挑戰。相互作用的組分可以順序添加或在固定前一起孵育以在溶液中形成復合物。分析優化中使用的陽性對照或對照至關重要。為了反映異質性APA反應，優選多克隆陽性對照抗體，而不是高親和力mAb。或者，可以使用代表一系列親和力的一系列陽性對照mAb。抗獨特型mAb也可用作陽性對照。此外，建立分析對產品存在的耐受性很重要，因為樣品通常在循環產品仍然存在的時間點收集。可以通過在分析中加入酸解離步驟來增加分析的藥物耐受性，在該步驟中，用酸處理血清樣品以解離產品-APA復合物。

免疫原性分析也可以基于SPR分析。SPR在檢測高親和力抗體方面可能不如其他方法敏感，但具有檢測低親和力抗體，特別是那些具有快速解離的抗體的優勢。SPR分析可以適應包括酸處理以增加藥物耐受性。使用SPR，可以直截了當地使用一系列同種型特異性抗體來表征APA的同種型，但不能使用與產品結合的抗同種型抗體。可以使用二抗來增加SPR信號并提高分析敏感性。開發并合格了一種同時表征APA同種型和結合區（Fc或Fab）的SPR分析。在該分析中，生物素化的全長tociluzumab、Fc或Fab片段被固定在單獨的流通池上，然后將血清樣品注入所有流通池，隨后是同種型特異性抗體。這種分析格式可以適用于ADC，以檢測針對mAb、連接子和藥物組分的APA，盡管我們尚未知悉已發表的報道。

對于ADC，一個重要的考慮是評估APA是針對mAb、連接子還是藥物部分引發的。Hoofling及其同事開發并測試了兩種評估表位的方法。一種分析是使用未標記的mAb或藥物偶聯的BSA作為競爭劑的競爭分析。另一種分析在檢測步驟中使用標記的mAb或藥物偶聯的BSA。使用在過量抗mAb抗體存在下用低濃度抗藥物抗體加標的樣品，或反之亦然，測試了兩種分析的特異性。發現競爭分析產生假陰性結果。相比之下，直接分析的特異性得到確認，除非存在非常大量的抗主要表位的抗體。

承認開發合適的免疫原性分析存在許多挑戰，FDA支持在產品開發期間逐步開發和驗證分析，除非認為發生APA相關不良事件的風險很高。在分析和測試被開發和合格之前，患者的樣品應在適當的儲存條件下儲存。對于ADC，建議開發能夠區分對mAb和藥物組分的免疫反應的分析。

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結語

由于ADC的復雜性質，一些QC測試在偶聯前的中間體上執行可能更有效。例如，藥物-連接子相關雜質在藥物-連接子中間體階段通過完整的雜質譜分析進行控制。這些雜質可以分為可偶聯和不可偶聯的雜質。在控制這些雜質時應采用基于風險的方法。對于mAb的表征和放行測試，應在mAb中間體階段和ADC上測試相關屬性，以便進行比較以確定偶聯是否導致質量屬性的任何變化。通常，mAb和藥物-連接子中間體的表征、放行和穩定性測試應與DS的方式相同。

鑒于ADC的復雜性以及該領域當前不斷發展的科學和技術，本文討論的分析方法開發策略包括制藥行業中常用的方法。它們可能不適用于每個單獨的ADC。在開發QC分析時，建議咨詢并酌情應用相關的ICH指南。

參考文獻：

1.Antibody-Drug Conjugates Fundamentals, Drug Development, and Clinical Outcomes to Target Cancer (Kenneth J. Olivier Jr., Sara A. Hurvitz (eds.))

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