《食品科學(xué)》：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)陳歷俊教授級高級工程師等：單細(xì)胞RNA測序在乳源細(xì)胞中的應(yīng)用研究與進(jìn)展

哺乳動物乳汁是新生幼崽早期生命階段的主要營養(yǎng)來源，其成分的復(fù)雜性和動態(tài)變化一直以來都是泌乳生物學(xué)領(lǐng)域研究的核心內(nèi)容。乳汁絕非是營養(yǎng)物質(zhì)的簡單機(jī)械混合，而是一個富含生物活性成分的復(fù)雜體系，這些成分相互協(xié)同，共同發(fā)揮獨(dú)特的生物學(xué)效應(yīng)。

近年來，單細(xì)胞RNA測序（scRNA-seq）技術(shù)的出現(xiàn)為乳源細(xì)胞研究帶來了革命性突破。該技術(shù)能夠在單細(xì)胞分辨率下獲取基因組、轉(zhuǎn)錄組及表觀遺傳學(xué)等多組學(xué)信息，從而精準(zhǔn)解析細(xì)胞間的異質(zhì)性，為深入揭示乳源細(xì)胞的組成、功能及其在乳腺發(fā)育、生理調(diào)控和病理變化中的作用機(jī)制提供了強(qiáng)有力工具。

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院的任佳慧，北京三元食品股份有限公司的張珍珍、陳歷俊*等詳細(xì)概述乳中各類細(xì)胞的類型及其生物學(xué)特征，隨后闡述scRNA-seq技術(shù)的原理與優(yōu)勢，最后重點(diǎn)總結(jié)該技術(shù)在乳源細(xì)胞研究領(lǐng)域的應(yīng)用，希望能為乳源細(xì)胞研究提供一定的理論參考。

01

乳源細(xì)胞的主要類型

哺乳動物的乳汁是一種復(fù)雜的生物液體，不僅為后代提供必要的營養(yǎng)物質(zhì)，還含有多種功能性細(xì)胞，包括管腔上皮細(xì)胞、基底上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞和干細(xì)胞等（表1）。這些細(xì)胞在母體與后代中各自發(fā)揮著不同的作用。管腔上皮細(xì)胞和基底上皮細(xì)胞主要負(fù)責(zé)乳的合成和分泌，同時參與乳腺組織的重建和修復(fù)。免疫細(xì)胞在乳中起到免疫防御作用，幫助哺乳動物新生個體抵抗病原體入侵。乳中的干細(xì)胞具有自我更新和多向分化潛能，可能參與新生個體組織的發(fā)育和修復(fù)。這些細(xì)胞的協(xié)同作用不僅保障了新生兒和幼仔的營養(yǎng)需求，還為其提供了免疫保護(hù)和發(fā)育支持，對母體和后代健康具有重要意義。

1.1 管腔上皮細(xì)胞

根據(jù)分化狀態(tài)和功能異質(zhì)性，乳中的管腔上皮細(xì)胞根據(jù)分化狀態(tài)和功能異質(zhì)性，可分為管腔祖細(xì)胞和成熟管腔細(xì)胞，二者共同維持乳腺的發(fā)育、功能調(diào)控及病理狀態(tài)下的動態(tài)平衡。研究表明，這些細(xì)胞均起源于乳腺干細(xì)胞，并在乳腺的生長、發(fā)育及功能調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

1.1.1管腔祖細(xì)胞

管腔祖細(xì)胞在乳腺發(fā)育中扮演著極為關(guān)鍵的角色。研究表明，管腔祖細(xì)胞通常表達(dá)CD49f和EpCAM標(biāo)記物。其中，CD49f是基底細(xì)胞和干細(xì)胞的重要標(biāo)記物，而EpCAM則廣泛表達(dá)于上皮細(xì)胞中，這也賦予了管腔祖細(xì)胞獨(dú)特的細(xì)胞標(biāo)識。青春期乳腺發(fā)育的主要特征包括導(dǎo)管的延長、分支和增生，這一過程受到多種激素的調(diào)控，尤其是雌激素和孕激素的作用。雌激素刺激乳腺導(dǎo)管的延長和分枝，而孕激素則促進(jìn)導(dǎo)管的增生和分支形成。此外，生長激素和胰島素樣生長因子1也在青春期乳腺發(fā)育中起重要作用，它們通過與雌激素協(xié)同作用，促進(jìn)導(dǎo)管上皮細(xì)胞的增殖和分化。在妊娠和泌乳期，部分管腔祖細(xì)胞可進(jìn)一步分化為腺泡細(xì)胞，形成乳腺腺泡，并負(fù)責(zé)乳汁的合成與分泌。有研究表明，Kindlin-2在肌上皮細(xì)胞中是妊娠期管腔祖細(xì)胞向腺泡細(xì)胞分化的重要調(diào)控因子。Wang Zhenbin等利用5 種不同基因修飾的小鼠模型并結(jié)合scRNA-seq技術(shù)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)肌上皮細(xì)胞中缺失Kindlin-2會顯著影響乳腺形態(tài)發(fā)生、腺泡細(xì)胞形成及泌乳功能。機(jī)制研究顯示，Kindlin-2缺失會導(dǎo)致信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）3活化及δ樣配體1上調(diào)，從而激活管腔細(xì)胞中的Notch信號通路，進(jìn)而抑制妊娠期管腔祖細(xì)胞的分化和成熟。單細(xì)胞譜分析進(jìn)一步證實，Kindlin-2的缺失會導(dǎo)致成熟腺泡細(xì)胞比例顯著下降。此外，通過應(yīng)用橘皮素抑制Notch1信號，可部分恢復(fù)Kindlin-2缺失小鼠妊娠期管腔祖細(xì)胞的正常分化能力。這一研究表明該信號軸通過抑制管腔細(xì)胞的Notch通路從而促進(jìn)管腔祖細(xì)胞向腺泡細(xì)胞分化。

管腔祖細(xì)胞不僅在正常乳腺發(fā)育和功能中起重要作用，還與乳腺疾病的發(fā)生密切相關(guān)。乳腺癌是一種多樣化的疾病，可根據(jù)分子基因特征至少分為6 種臨床相關(guān)亞型，這些亞型大致歸屬于“基底型”或“管腔型”兩大類。多項研究表明，乳腺癌的不同亞型起源具有異質(zhì)性，可能起源于乳腺上皮細(xì)胞發(fā)育進(jìn)程中的不同階段，而管腔祖細(xì)胞被認(rèn)為是乳腺癌的潛在起源細(xì)胞，例如乳腺癌亞型（如基底樣乳腺癌和管腔A/B亞型）細(xì)胞。哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究團(tuán)隊通過scRNA-seq揭示了三陰性乳腺癌（TNBC）的亞克隆異質(zhì)性及其與侵襲性疾病狀態(tài)的關(guān)聯(lián)。研究人員對未經(jīng)治療的原發(fā)性TNBC腫瘤細(xì)胞進(jìn)行了scRNA-seq，結(jié)果證實其存在明顯的細(xì)胞異質(zhì)性。通過聚類分析，他們識別出5 個不同的上皮細(xì)胞群，其中第2細(xì)胞群具備較高的增殖能力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該細(xì)胞群具有乳腺癌起源細(xì)胞——管腔祖細(xì)胞的特征，并被認(rèn)定為是一種惡性細(xì)胞亞群。由于其強(qiáng)大的增殖潛能，該亞群可能在推動腫瘤進(jìn)展方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，并與TNBC患者較差的生存預(yù)后密切相關(guān)。因此，深入研究管腔祖細(xì)胞的生物學(xué)特性及其調(diào)控機(jī)制，對于理解乳腺疾病的發(fā)病機(jī)制和開發(fā)新的治療策略具有重要意義。

1.1.2成熟管腔細(xì)胞

成熟管腔上皮細(xì)胞的形成通常經(jīng)歷從未分化狀態(tài)到分化的多階段進(jìn)程。例如，在乳腺發(fā)育過程中，未分化上皮細(xì)胞逐漸分化為成熟管腔細(xì)胞，與周圍的其他細(xì)胞和組織共同維持乳腺的正常形態(tài)結(jié)構(gòu)，并通過基因表達(dá)調(diào)控完成功能特化。在女性生理周期中，成熟管腔上皮細(xì)胞的數(shù)量和活性會隨著激素水平的變化而改變，這是乳腺正常生理功能的一部分。成熟管腔上皮細(xì)胞包括多種功能亞群，如激素反應(yīng)性上皮細(xì)胞和分泌上皮細(xì)胞，這兩種細(xì)胞均表達(dá)典型的標(biāo)志物角蛋白（CK）8和CK18，它們在導(dǎo)管和小葉中共存。激素反應(yīng)性上皮細(xì)胞是乳腺中的一類特殊細(xì)胞，位于乳腺導(dǎo)管的管腔中，從分子標(biāo)志物的表達(dá)來看，這類細(xì)胞通常呈現(xiàn)出高表達(dá)雌激素受體/孕激素受體（ER/PR）的特征，這顯示出其對雌激素和孕激素信號的高度敏感性。ER和PR是乳腺上皮細(xì)胞中重要的激素受體，ER主要在乳腺導(dǎo)管的基底細(xì)胞中表達(dá)，而PR則在腺泡細(xì)胞中表達(dá)，兩者共同調(diào)控乳腺的生長和發(fā)育，這種協(xié)調(diào)表達(dá)是確保乳腺功能正常的基礎(chǔ)。在女性生理周期中，成熟管腔上皮細(xì)胞的數(shù)量和活性會隨著激素水平的變化而改變，這是乳腺正常生理功能的一部分。在某些病理狀態(tài)下，如乳腺增生和乳腺癌，管腔中的激素反應(yīng)性上皮細(xì)胞會表現(xiàn)出異常的形態(tài)、增殖速率和功能，這些異?？赡芘c受體突變、信號通路異?；蜻z傳背景有關(guān)。管腔分泌上皮細(xì)胞具有分泌功能，主要負(fù)責(zé)乳汁的合成與分泌。在激素（如催乳素）的刺激下，它們通過激活Janus激酶2（JAK2）/STAT5信號通路上調(diào)乳蛋白（如β-酪蛋白、乳鐵蛋白等）基因的表達(dá)，促進(jìn)乳汁中各種成分的合成，并通過生化反應(yīng)和物質(zhì)運(yùn)輸將營養(yǎng)物質(zhì)和活性物質(zhì)輸送到乳腺導(dǎo)管管腔中，最終形成乳汁。這一過程對新生兒的發(fā)育和乳腺內(nèi)的穩(wěn)態(tài)維持至關(guān)重要。在青春期和妊娠期，這些細(xì)胞在激素的作用下增殖和分化，形成乳腺導(dǎo)管的管腔和小葉結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)的形成對于維持正常乳腺功能和泌乳是必要的。管腔分泌上皮細(xì)胞也與乳腺疾病相關(guān)，通常在疾病狀態(tài)下，這些細(xì)胞會表現(xiàn)出異常的增殖、分化或功能障礙。深入研究這些細(xì)胞可以進(jìn)一步揭示乳腺疾病的機(jī)制，并為開發(fā)新的治療方法提供依據(jù)。

1.2 基底上皮細(xì)胞

基底上皮細(xì)胞是乳腺上皮的基底層細(xì)胞，它們位于導(dǎo)管的基底部，與結(jié)締組織直接接觸，并通過基底膜與外界隔開，通常與腔面上皮細(xì)胞共同構(gòu)成乳腺導(dǎo)管的雙層結(jié)構(gòu)。它主要來源于乳腺組織內(nèi)的干細(xì)胞或祖細(xì)胞，其特征性分子標(biāo)志物如細(xì)胞CK5和CK14等?；兹橄偕掀ぜ?xì)胞具有較高的祖細(xì)胞活性和可塑性，它們可以分化為肌上皮細(xì)胞。肌上皮細(xì)胞位于乳腺腺泡的外表面，表達(dá)多種收縮相關(guān)的蛋白，如肌動蛋白、肌球蛋白和鈣調(diào)蛋白，能夠進(jìn)行有效的收縮，這種收縮能力是泌乳過程的核心動力，確保乳汁能夠順利流動。在哺乳期，催乳素的作用尤為重要。當(dāng)嬰兒吸吮乳頭時，刺激神經(jīng)末梢釋放催乳素，進(jìn)一步促進(jìn)乳腺肌上皮細(xì)胞的收縮，從而增加乳汁的分泌和排出量?；咨掀ぜ?xì)胞是乳腺導(dǎo)管形成和重塑的關(guān)鍵細(xì)胞類型，它們通過與腔上皮細(xì)胞共同形成雙層結(jié)構(gòu)，參與導(dǎo)管的構(gòu)建和擴(kuò)展。基底上皮細(xì)胞具有分泌功能，能夠產(chǎn)生多種細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分，包括IV型膠原、層黏連蛋白和纖維連接蛋白等，這些成分對基底膜的形成和功能至關(guān)重要?；啄げ粌H為上皮細(xì)胞提供物理屏障，還通過與ECM的相互作用調(diào)控細(xì)胞行為，如遷移、增殖和分化。例如，IV型膠原是基底膜的重要結(jié)構(gòu)成分，能夠提供分子支架并參與細(xì)胞黏附和遷移。Nyquist等通過對人乳細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq測序，發(fā)現(xiàn)人乳中存在極少數(shù)基底上皮細(xì)胞。同樣，Zorc等在對牛乳進(jìn)行scRNA-seq測序時也得到了相似的結(jié)果，牛乳中同樣僅存在極少數(shù)基底上皮細(xì)胞。有研究推測這些基底上皮細(xì)胞可能是在乳腺上皮的動態(tài)更新或損傷修復(fù)過程中進(jìn)入乳汁。

1.3 免疫細(xì)胞

乳中的免疫細(xì)胞是指存在于乳汁內(nèi)并發(fā)揮免疫防御功能的各類細(xì)胞，這些細(xì)胞包括淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等。這些細(xì)胞共同構(gòu)成了一個復(fù)雜的免疫細(xì)胞群體，在乳汁中共同發(fā)揮免疫功能，以維護(hù)后代健康。早在20世紀(jì)60年代后期，研究人員即發(fā)現(xiàn)初乳中富含白細(xì)胞，由于早期主要依賴視覺識別，白細(xì)胞的濃度常被高估，長期以來白細(xì)胞被認(rèn)為是是母乳中最豐富的細(xì)胞。近年來，隨著流式細(xì)胞術(shù)等先進(jìn)技術(shù)的逐漸應(yīng)用，研究人員能夠更精確地識別和定量母乳中各種細(xì)胞類型。最新數(shù)據(jù)顯示，白細(xì)胞僅占健康母親成熟乳中細(xì)胞的一小部分（＜2%）。而不同的泌乳階段，乳汁中白細(xì)胞的數(shù)量和組成也會發(fā)生變化，Trend等使用流式細(xì)胞術(shù)對健康女性母乳中的白細(xì)胞亞群進(jìn)行鑒定和定量分析，發(fā)現(xiàn)初乳中約含有白細(xì)胞1.46×105 個/mL，過渡期（產(chǎn)后8～12 d）和成熟乳（產(chǎn)后26～30 d）中的數(shù)量分別減少至2.75×104 個/mL和2.37×104 個/mL。Trend等的研究還揭示，母乳中的白細(xì)胞亞群比之前認(rèn)為的更加多樣化，鑒定出的主要的白細(xì)胞類型是骨髓前體細(xì)胞（9%～20%）、中性粒細(xì)胞（12%～27%）、未成熟粒細(xì)胞（8%～17%）和非細(xì)胞毒性T細(xì)胞（6%～7%）。作為主動免疫的重要組成部分，乳源白細(xì)胞能夠增強(qiáng)嬰兒的免疫能力，同時可能在防止乳腺感染方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。

乳中免疫因子從母親到嬰兒的轉(zhuǎn)移開始于子宮內(nèi)，并在產(chǎn)后通過母乳喂養(yǎng)得以延續(xù)。來自動物研究的證據(jù)表明，母乳白細(xì)胞能夠通過嬰兒的消化道存活下來，并進(jìn)一步從胃腸道轉(zhuǎn)移至血液以及遠(yuǎn)端部位，如淋巴結(jié)、脾臟和肝臟等。乳中的免疫細(xì)胞憑借其多樣的來源、獨(dú)特的特性和功能，在母嬰健康中發(fā)揮關(guān)鍵作用。例如，母乳中的先天性淋巴細(xì)胞通過母乳傳遞到嬰兒腸道，直接參與腸道免疫系統(tǒng)的發(fā)育和調(diào)節(jié)。上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞在腸道上皮細(xì)胞中表達(dá)特定整合素（如整合素αEβ7），并與E-鈣黏蛋白相互作用，可能參與口腔免疫耐受的形成，降低相關(guān)疾病風(fēng)險。乳中的免疫細(xì)胞憑借其多樣的來源、獨(dú)特的特性和獨(dú)特的免疫功能，對這些免疫細(xì)胞的深入研究有助于進(jìn)一步理解母乳喂養(yǎng)的重要性以及母嬰免疫傳遞的機(jī)制。

1.4 干細(xì)胞

2007年，研究人員發(fā)現(xiàn)了母乳中表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記物CK5和巢蛋白，證明了母乳中存在干細(xì)胞。人母乳干細(xì)胞（hBSCs）是從母乳中分離得到的一類獨(dú)特的干細(xì)胞，具有自我更新和多向分化的能力。Hassiotou等觀察到，在hBSCs的增殖過程中，類似于人類胚胎干細(xì)胞（hESCs），hBSCs表達(dá)與細(xì)胞自我更新相關(guān)的核心多能因子——八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4（OCT4）、SRY盒轉(zhuǎn)錄因子2（SOX2）和Nanog同源盒轉(zhuǎn)錄因子（NANOG），支持其自我更新。當(dāng)培養(yǎng)在小鼠成纖維細(xì)胞上時，hBSCs形成類似于hESCs的克隆集落。2010年，Patki等進(jìn)一步探究hBSCs的分化特性，發(fā)現(xiàn)hBSCs和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞具有相似的特性，能夠分化成3 種細(xì)胞類型：形成導(dǎo)管和小泡基底層的肌上皮細(xì)胞、導(dǎo)管內(nèi)壁的導(dǎo)管上皮細(xì)胞，以及合成乳汁蛋白的腺泡上皮細(xì)胞。也有研究發(fā)現(xiàn)hBSCs具有分化成三胚層細(xì)胞的能力，包括中胚層細(xì)胞，如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和心肌細(xì)胞；內(nèi)胚層細(xì)胞，如胰腺β細(xì)胞和肝細(xì)胞；以及外胚層細(xì)胞，如少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元樣細(xì)胞（圖1）。然而，盡管對hBSCs的特性有了諸多發(fā)現(xiàn)，目前仍缺乏對hBSCs分化過程精確調(diào)控因素的深入理解。但隨著scRNA-seq和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)等前沿技術(shù)的快速發(fā)展，未來的研究預(yù)計能精確揭示hBSCs在單細(xì)胞水平上的潛在功能和分化軌跡，為全面了解其生物學(xué)特性提供機(jī)會。而從hBSCs對嬰兒發(fā)育的影響來看，hBSCs可能在母乳喂養(yǎng)過程中轉(zhuǎn)移到嬰兒體內(nèi)，在多種器官、組織和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的發(fā)揮重要作用。Allah等將PKH26標(biāo)記的兔子乳腺間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）樣細(xì)胞懸浮在2 mL DMEM中，喂給兔子并追蹤它們在不同器官中的嵌合情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，BMSCs樣細(xì)胞可以轉(zhuǎn)移到后代的器官，如肝臟、軟骨、骨骼和十二指腸。與喂食初級乳腺成纖維細(xì)胞或DMEM對照組的兔子相比，BMSCs樣細(xì)胞喂養(yǎng)組的體質(zhì)量顯著增加，所有器官中過度表達(dá)細(xì)胞周期蛋白——增殖細(xì)胞核抗原和細(xì)胞周期蛋白D1，并且肝臟和軟骨中細(xì)胞增殖增加。研究人員由此推測hBSCs也可能通過嬰兒的腸黏膜進(jìn)入血液，達(dá)到各個器官和組織，促進(jìn)發(fā)育、修復(fù)和再生，這在嬰兒早期發(fā)育和生長中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。

類似地，Pipino等從牛乳中分離并鑒定出具有干細(xì)胞樣特性的細(xì)胞群，稱為牛乳干細(xì)胞（bMSCs）。這些細(xì)胞具有貼壁生長特性，呈現(xiàn)出由上皮細(xì)胞和梭形細(xì)胞組成的異質(zhì)細(xì)胞群特征。免疫表型分析顯示，牛乳細(xì)胞表達(dá)典型的上皮細(xì)胞標(biāo)志物，如E-鈣黏蛋白、CK14、CK18和平滑肌肌動蛋白。值得注意的是，30%～40%的牛乳細(xì)胞亞群持續(xù)表達(dá)間充質(zhì)表面抗原CD90、CD73和CD105，并且這些細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)存在干性標(biāo)志物SOX2和OCT4的轉(zhuǎn)位現(xiàn)象。研究還證實bMSCs能夠分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。在奶牛體內(nèi)，乳腺干或祖細(xì)胞的數(shù)量和活性可能是影響泌乳的關(guān)鍵因素。干細(xì)胞能夠分化為乳腺上皮細(xì)胞，從而增加乳腺上皮細(xì)胞的數(shù)量，提高泌乳量并延長泌乳期。此外，乳腺干細(xì)胞通過促進(jìn)奶牛青春期乳腺的發(fā)育以及在乳腺炎誘導(dǎo)損傷中的組織修復(fù)，對提高泌乳效率發(fā)揮著重要作用。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步表明，乳源干細(xì)胞具有多向分化潛能。

02

scRNA-seq技術(shù)

2.1 scRNA-seq技術(shù)簡介

scRNA-seq技術(shù)是指在單細(xì)胞水平上對基因組進(jìn)行高通量測序分析的技術(shù)。自2009年Tang Fuchou等成功開發(fā)scRNA-seq技術(shù)以來，該技術(shù)得到了顯著發(fā)展。scRNA-seq技術(shù)能夠精確解析單個細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組特征，為研究同一生物體內(nèi)不同類型細(xì)胞間的異質(zhì)性提供了強(qiáng)有力的工具。借助scRNA-seq技術(shù)，研究人員能夠在轉(zhuǎn)錄組水平上對單個細(xì)胞進(jìn)行精確分類、鑒定和功能表征，這有助于發(fā)現(xiàn)罕見但功能重要的細(xì)胞群體。與傳統(tǒng)方法相比，scRNA-seq技術(shù)的顯著優(yōu)勢在于無需進(jìn)行選擇性細(xì)胞分離就可對單個細(xì)胞中的RNA或DNA進(jìn)行定量分析。此外，它還能與熒光激活細(xì)胞分選、配體-受體相互作用分析和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)聯(lián)用，用于分析細(xì)胞間的相互作用、細(xì)胞的空間位置以及分子間的串?dāng)_。隨著細(xì)胞分選、核酸提取等技術(shù)的不斷進(jìn)步，scRNA-seq技術(shù)也取得了長足的進(jìn)步。在眾多適用于scRNA-seq技術(shù)的平臺中，10x Genomics、BD Rhapsody以及Fluidigm C1等較為常用（表2）。10x Genomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄平臺憑借成本效益和通量方面的顯著優(yōu)勢，成為目前應(yīng)用最為廣泛的scRNA-seq測序方法之一，在相關(guān)研究中備受青睞。隨著微流控技術(shù)和高通量測序技術(shù)的進(jìn)步，基于液滴微流控、微孔板自動化和組合索引等新型scRNA-seq技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，極大地提高了scRNA-seq的通量，降低了成本，并簡化了實驗流程。

2.2 scRNA-seq技術(shù)的實驗流程

scRNA-seq技術(shù)的實驗流程包括以下關(guān)鍵步驟：首先是單細(xì)胞懸液制備，這一步需要將組織樣本通過機(jī)械解離、酶消化等方法處理成單細(xì)胞狀態(tài)，或者將液體樣本離心取細(xì)胞沉淀，確保細(xì)胞的完整性和活性。接著進(jìn)行單細(xì)胞捕獲，可采用多種方法，如基于微流控芯片的液滴法、微孔板法等，將單個細(xì)胞精準(zhǔn)地捕獲到特定的反應(yīng)體系中。捕獲后的單細(xì)胞經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到互補(bǔ)DNA（cDNA），逆轉(zhuǎn)錄過程需要特定的逆轉(zhuǎn)錄酶和引物，將細(xì)胞內(nèi)的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。最后對cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，以增加DNA的量，以滿足后續(xù)測序的需求。測序完成后，需要進(jìn)行一系列下游分析，以確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可解釋性。首先，進(jìn)行堿基檢測，通過特定的算法和軟件識別測序數(shù)據(jù)中的堿基。隨后開展多重分離、比對及基因識別，將測序得到的短序列與已知的基因組序列進(jìn)行比對，確定其在基因組中的位置并識別對應(yīng)的基因。最后，通過數(shù)據(jù)可視化與解讀，將龐大復(fù)雜的測序數(shù)據(jù)以直觀的圖表等形式展示出來，便于研究者分析和理解（圖2）。

2.3 scRNA-seq技術(shù)在乳源細(xì)胞中的應(yīng)用

scRNA-seq技術(shù)已經(jīng)在乳腺細(xì)胞研究中取得了顯著進(jìn)展，近年來，scRNA-seq技術(shù)在乳源細(xì)胞中的研究為揭示乳腺生理功能和細(xì)胞異質(zhì)性提供了新視角（圖3）。傳統(tǒng)研究方法如顯微鏡觀察、流式細(xì)胞術(shù)和批量RNA測序雖為乳源細(xì)胞研究奠定了基礎(chǔ)，但存在明顯的局限性。顯微鏡觀察雖能直觀地看到細(xì)胞形態(tài)，但無法提供分子水平信息；流式細(xì)胞術(shù)能夠分析細(xì)胞表面標(biāo)志物，但對細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)情況了解有限；批量RNA測序雖可提供基因表達(dá)譜，但掩蓋了細(xì)胞間的異質(zhì)性，無法反映單個細(xì)胞的特性。scRNA-seq技術(shù)的出現(xiàn)解決了這些問題，能夠在單細(xì)胞水平上進(jìn)行無偏倚、高通量、高分辨率的轉(zhuǎn)錄組分析，精確揭示每個細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組信息，并發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞類型。自Tang Fuchou等報道scRNA-seq技術(shù)以來，Smart-seq、Drop-seq、10x Genomics等一系列技術(shù)的問世顯著提高了scRNA-seq的通量和準(zhǔn)確性，為乳源細(xì)胞研究提供了有力工具。

2.3.1 scRNA-seq技術(shù)在人乳細(xì)胞研究中的應(yīng)用

在人乳細(xì)胞研究方面，2020年，Carli等認(rèn)為人乳中細(xì)胞是潛在的“液體乳腺活檢”寶貴資源，可用于非侵入性研究泌乳生理學(xué)。其運(yùn)用scRNA-seq測序技術(shù)對患有飲食控制型妊娠期糖尿病且泌乳正常的女性母乳進(jìn)行研究，鑒定母乳來源的乳腺上皮細(xì)胞及其轉(zhuǎn)錄特征，全面表征了兩名產(chǎn)后兩周母親乳樣本中的3 740 個細(xì)胞。這些細(xì)胞中大多數(shù)細(xì)胞是管腔上皮細(xì)胞，它們表達(dá)α-乳清蛋白和β-酪蛋白，且CK8和CK18呈陽性。少數(shù)細(xì)胞是CK14陽性的基底上皮細(xì)胞，同時存在少量免疫細(xì)胞。對各細(xì)胞簇間差異基因表達(dá)進(jìn)行分析，鑒定出6 種可能不同的乳腺管腔上皮細(xì)胞亞群特征，這表明乳腺管腔上皮細(xì)胞之間可能存在細(xì)微的功能差異，其中一個細(xì)胞簇同時對祖細(xì)胞標(biāo)記物和成熟乳轉(zhuǎn)錄本呈陽性。2022年，Twigger等通過分別采集了9 名捐贈者的母乳和7 名捐贈者的非哺乳期乳腺組織，分離得到110 744 個活的乳腺細(xì)胞，對這些細(xì)胞進(jìn)行scRNA-seq分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人乳中主要包含管腔譜系的上皮細(xì)胞，即管腔細(xì)胞群1和管腔細(xì)胞群2以及免疫細(xì)胞。對乳源細(xì)胞的進(jìn)一步轉(zhuǎn)錄組分析確定了兩種不同的分泌細(xì)胞類型，它們與管腔祖細(xì)胞有相似之處，但未發(fā)現(xiàn)可以響應(yīng)激素的細(xì)胞群。具體而言，通過鑒定哺乳期乳腺中正常功能相關(guān)的基因表達(dá)特征，并與癌癥基因組圖譜中不同乳腺癌分子亞型的轉(zhuǎn)錄特征進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)管腔祖細(xì)胞和管腔細(xì)胞群2特征基因在基底樣乳腺癌中顯著上調(diào)，而管腔細(xì)胞群1特征基因則未見明顯變化。這提示乳腺在妊娠及哺乳期間的細(xì)胞分化狀態(tài)與某些乳腺癌亞型（特別是基底樣乳腺癌）的起源或演變過程可能存在關(guān)聯(lián)。Nyquist等利用scRNAseq檢測分析了15 名捐贈者產(chǎn)后3～632 d不同哺乳階段人母乳中細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人母乳中的大多數(shù)細(xì)胞是泌乳細(xì)胞，這是一種特殊的上皮細(xì)胞亞群，并且細(xì)胞類型的頻率隨著哺乳階段而改變，后期上皮細(xì)胞的多樣性更高。該研究鑒定出人母乳中存在幾個巨噬細(xì)胞亞群，這些亞群細(xì)胞具備免疫耐受功能，可在哺乳期保護(hù)乳腺。2023年，Cansever等利用多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)和scRNA-seq技術(shù)鑒定出1 種小鼠母乳特有的巨噬細(xì)胞群體，它與妊娠前存在的兩種駐留型巨噬細(xì)胞亞群截然不同。這種特有的巨噬細(xì)胞群體主要來源于單核細(xì)胞，并且在哺乳期間通過原位增殖而擴(kuò)增。在局部，它們定位于肺泡基底細(xì)胞附近，并可外滲進(jìn)入乳汁中。這些研究表明，scRNA-seq技術(shù)在解析人乳及乳腺組織細(xì)胞組成、功能特征及其動態(tài)變化方面具有巨大潛力。通過對母乳細(xì)胞進(jìn)行深入分析，研究者不僅揭示了泌乳過程中不同上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞亞群的多樣性與功能特征，還初步建立了人類哺乳期乳腺細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組參考圖譜。這些工作能夠通過無創(chuàng)手段實現(xiàn)對乳腺生理和病理狀態(tài)的實時監(jiān)測，為深入理解妊娠、泌乳及相關(guān)疾病（如乳腺癌）之間的關(guān)系提供新的研究方向和診療參考。

2.3.2 scRNA-seq技術(shù)在牛乳細(xì)胞中的應(yīng)用

在牛乳細(xì)胞研究方面，Beckerd等指出，乳腺組織或原代奶牛乳腺上皮細(xì)胞（pbMECs）常被用作分子水平研究奶牛乳腺功能的模型，然而整體組織和原代細(xì)胞在細(xì)胞群體方面具有異質(zhì)性，除了遺傳背景差異外，還會增加轉(zhuǎn)錄水平的變異。盡管pbMECs與牛乳體細(xì)胞均來源于乳腺組織，但兩者在獲取方式和生理狀態(tài)上存在明顯差異：pbMECs是在體外條件下擴(kuò)增培養(yǎng)的乳腺上皮細(xì)胞，具有較高的純度，主要用于模擬乳腺上皮細(xì)胞的功能狀態(tài)；而牛乳體細(xì)胞則直接來源于泌乳牛的乳樣，包含乳腺上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞等多種細(xì)胞類型，能夠更真實地反映乳腺在泌乳過程中的復(fù)雜微環(huán)境。為了研究牛乳中的單核細(xì)胞組成，Beckerd等分析了一份牛乳樣本中的單細(xì)胞懸液和培養(yǎng)的pbMECs，其中的pbMECs用來表征在均一細(xì)胞群中的基因表達(dá)。利用Drop-seq技術(shù)生成了牛乳體細(xì)胞和pbMECs的單細(xì)胞RNA數(shù)據(jù)集。其中pbMECs形成了14 個界限不明確的細(xì)胞簇，顯示出群體內(nèi)的異質(zhì)性，而牛乳細(xì)胞則形成了14 個更為清晰的細(xì)胞簇。Becker等所得數(shù)據(jù)集構(gòu)成了一個分子細(xì)胞圖譜，為未來對牛乳細(xì)胞組成和基因表達(dá)的研究奠定了基礎(chǔ)，并且可以作為牛乳細(xì)胞分析的參考數(shù)據(jù)集。2023年，Zorc等利用10x Chromium平臺對處于泌乳中期的奶牛牛乳樣本進(jìn)行scRNA-seq分析，從單細(xì)胞層面剖析牛乳轉(zhuǎn)錄組。成功重構(gòu)出牛乳中的不同細(xì)胞類型（泌乳細(xì)胞、祖細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、肥大細(xì)胞和中性粒細(xì)胞）。這項研究結(jié)果為識別與乳腺各種功能包括泌乳、組織更新、天然免疫、蛋白質(zhì)和脂肪合成以及激素應(yīng)答等相關(guān)的調(diào)控元件提供了寶貴資源。

綜上所述，scRNA-seq技術(shù)在乳源細(xì)胞研究中已取得顯著進(jìn)展，為深入了解乳腺生理功能、細(xì)胞組成及相關(guān)調(diào)控機(jī)制提供了豐富信息。然而，目前的研究仍存在樣本量相對較小、對某些細(xì)胞功能和調(diào)控機(jī)制理解不夠深入等局限性。未來，隨著scRNA-seq技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，有望在更大樣本規(guī)模、更深入的分子機(jī)制層面開展研究，進(jìn)一步挖掘乳源細(xì)胞的奧秘，這不僅能為母嬰健康提供更精準(zhǔn)的哺育方案，還有利于推動乳業(yè)朝著更優(yōu)質(zhì)、更安全的方向發(fā)展，全方位造福于乳品健康領(lǐng)域。但是研究過程中也要注意倫理與標(biāo)準(zhǔn)化問題，未來要進(jìn)一步規(guī)范母乳樣本采集的倫理規(guī)范（如捐贈者知情同意、隱私保護(hù)）。同時注意數(shù)據(jù)共享與標(biāo)準(zhǔn)化，建立乳源細(xì)胞單細(xì)胞數(shù)據(jù)庫，促進(jìn)跨研究比較。

結(jié)語

scRNA-seq技術(shù)通過對單個細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行解析，突破了傳統(tǒng)群體測序的平均掩蓋效應(yīng)，實現(xiàn)了從“群體均值”向“單細(xì)胞精度”的轉(zhuǎn)變。在乳源細(xì)胞的研究中，該技術(shù)不僅揭示了乳源管腔上皮細(xì)胞、基底細(xì)胞、免疫細(xì)胞及干細(xì)胞等群體的異質(zhì)性組成與功能分工，更通過動態(tài)轉(zhuǎn)錄圖譜的構(gòu)建闡明了其在母嬰免疫傳遞、乳腺穩(wěn)態(tài)維持中的核心作用。未來，隨著scRNA-seq與空間轉(zhuǎn)錄組、多組學(xué)集成、活細(xì)胞成像等前沿技術(shù)融合，乳源細(xì)胞研究將從二維圖譜拓展至三維空間及時間維度的系統(tǒng)解析。建立不同生理階段與疾病狀態(tài)下的乳源細(xì)胞圖譜，不僅可為提升乳品品質(zhì)與泌乳效率提供精準(zhǔn)干預(yù)靶點(diǎn)，也將為母嬰健康管理、乳腺疾病早篩及功能性乳制品開發(fā)開辟新路徑。scRNA-seq技術(shù)作為推動乳研究走向精準(zhǔn)化與系統(tǒng)化的關(guān)鍵引擎，正引領(lǐng)乳源生物學(xué)邁入跨越基礎(chǔ)研究、醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化與農(nóng)業(yè)優(yōu)化的新時代。

引文格式：

任佳慧, 張珍珍, 羅昌俊, 等. 單細(xì)胞RNA測序在乳源細(xì)胞中的應(yīng)用研究與進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2025, 46(20): 432-441. DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250307-062.

REN Jiahui, ZHANG Zhenzhen, LUO Changjun, et al. Recent advances and application of single-cell RNA sequencing to milk-derived cells[J]. Food Science, 2025, 46(20): 432-441. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250307-062.

實習(xí)編輯：南伊；責(zé)任編輯：張睿梅。點(diǎn)擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網(wǎng)

為匯聚全球智慧共探產(chǎn)業(yè)變革方向，搭建跨學(xué)科、跨國界的協(xié)同創(chuàng)新平臺，由北京食品科學(xué)研究院、中國肉類食品綜合研究中心、國家市場監(jiān)督管理總局技術(shù)創(chuàng)新中心（動物替代蛋白）、中國食品雜志社《食品科學(xué)》雜志（EI收錄）、中國食品雜志社《Food Science and Human Wellness》雜志（SCI收錄）、中國食品雜志社《Journal of Future Foods》雜志（ESCI收錄）主辦，西南大學(xué)、 重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院、 重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工業(yè)技術(shù)創(chuàng)新聯(lián)盟、重慶工商大學(xué)、重慶三峽學(xué)院、西華大學(xué)、成都大學(xué)、四川旅游學(xué)院、西昌學(xué)院、北京聯(lián)合大學(xué)協(xié)辦的“ 第三屆大食物觀·未來食品科技創(chuàng)新國際研討會 ”， 將于2026年4月25-26日 （4月24日全天報到） 在中國 重慶召開。

長按或微信掃碼進(jìn)行注冊

會議招商招展

聯(lián)系人：楊紅；電話：010-83152138；手機(jī)：13522179918（微信同號）