動(dòng)物行為實(shí)驗(yàn)指南丨光纖記錄結(jié)合五項(xiàng)選擇連續(xù)反應(yīng)時(shí)任務(wù)（5-CSRTT）

限水階段

小鼠經(jīng)過三天的適應(yīng)性飼養(yǎng)，進(jìn)入連續(xù)8天的限制性供水階段，供水時(shí)間依次為4h、3.5h、3h、2.5h、2h、1.5h、1h、0.5h，在每日上午十點(diǎn)稱量其體重，當(dāng)小鼠體重低于前體重的90%時(shí)，可以認(rèn)為小鼠的限制性斷水取得了理想的結(jié)果，如低于前重量的80%時(shí)，應(yīng)注意小鼠的健康狀況，防止因過量缺水導(dǎo)致行動(dòng)能力下降甚至死亡。限水結(jié)束后進(jìn)行行為學(xué)訓(xùn)練，之后的每天行為訓(xùn)練結(jié)束后，定時(shí)補(bǔ)水15min。

適應(yīng)性訓(xùn)練階段

健康狀況達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的小鼠，進(jìn)入到適應(yīng)性訓(xùn)練階段，此階段分為四個(gè)階段：在第一階段，運(yùn)行5-choice Habituation1程序（10min），此階段小鼠可以自由的在操作箱中進(jìn)行探索，操作箱的屏幕和槽燈此階段都不會(huì)被點(diǎn)亮，也不提供糖水獎(jiǎng)勵(lì)。在第二階段，運(yùn)行5-choice Habituation2（30min，100試次），此階段五孔屏幕燈不會(huì)亮，但是食物口槽燈會(huì)亮，當(dāng)小鼠觸碰槽燈后將獲得液體獎(jiǎng)勵(lì)（2%蔗糖），小鼠通過反復(fù)觸碰槽燈，在此階段建立起槽燈和糖水獎(jiǎng)勵(lì)之間的連接。當(dāng)小鼠完成100試次或者實(shí)驗(yàn)累積時(shí)間達(dá)到30min后一輪實(shí)驗(yàn)結(jié)束。當(dāng)獲得獎(jiǎng)賞的次數(shù)≥50次，小鼠進(jìn)入到第三階段，否則重復(fù)第二階段，直到達(dá)標(biāo)為止。第三階段，運(yùn)行的是5-choice Touch Training程序（30min，100試次），隨機(jī)點(diǎn)亮5塊屏幕(4cm×4cm)，當(dāng)小鼠觸碰屏幕后，操作箱的槽燈被點(diǎn)亮，小鼠觸碰被點(diǎn)亮的槽燈后，隨即槽口泵出糖水，給予其獎(jiǎng)勵(lì)。接著五塊屏幕將隨機(jī)被點(diǎn)亮（無間隔時(shí)間）以進(jìn)入下一個(gè)試次。獲得獎(jiǎng)勵(lì)次數(shù)≥50次的小鼠進(jìn)入第四階段。第四階段運(yùn)行的是5-choice Touch Training4程序（30min，100試次），此階段與第三階段基本相同，不同之處在于，小鼠獲得獎(jiǎng)勵(lì)后，有一個(gè)5秒的時(shí)間間隔。當(dāng)小鼠的正確試次≥50次時(shí)，就進(jìn)入到訓(xùn)練階段。

- 小鼠五孔注意力測試系統(tǒng)，上海欣軟 -

訓(xùn)練階段

小鼠在完成適應(yīng)性訓(xùn)練階段后進(jìn)入到訓(xùn)練階段。訓(xùn)練階段為循序漸進(jìn)的難度遞進(jìn)模式，共有6個(gè)階段。其中階段1屏幕亮屏?xí)r間(Stimulus duration,SD)持續(xù)30秒，30s的回合時(shí)間(Limited hold,LH)，以及2s的間隔時(shí)間(interval,ITI)。首先操作箱的槽燈亮起，小鼠觸碰其槽口，測試開始于5s Timeout(TO)之后。然后五塊屏幕被隨機(jī)點(diǎn)亮一個(gè)，當(dāng)小鼠在SD時(shí)間內(nèi)正確的觸碰屏幕時(shí)，將會(huì)出現(xiàn)聲音反饋提醒其操作正確。于此同時(shí)，槽燈將亮起，在LD時(shí)間內(nèi)小鼠觸碰槽口，將給予糖水獎(jiǎng)勵(lì)，隨后在ITI之后開始下一個(gè)試次。當(dāng)小鼠的反應(yīng)為過早(premature)、遺漏(omission)或者不正確（incorrect）時(shí)，程序會(huì)給予TO懲罰，伴隨著操作箱的室燈有5s的亮燈間隔。當(dāng)小鼠能夠連續(xù)兩天都滿足進(jìn)階標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，將進(jìn)入下一階段的訓(xùn)練程序。下一階段的SD和LD時(shí)間相對(duì)縮短，ITI的時(shí)間有所延長。

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測試階段

一旦小鼠在階段6中達(dá)到穩(wěn)定的性能，就進(jìn)入到測試階段。在光纖鈣成像實(shí)驗(yàn)中，選擇第4階段（SD5-LH5-ITI5）進(jìn)行測試。在化學(xué)遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)中，選擇階段6（SD1.8-LH5-ITI5）常規(guī)測試以及LITI（SD1.8-LH5-ITI7）挑戰(zhàn)測試進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。每次測試時(shí)間為30分鐘。

(3)aIC的坐標(biāo)位點(diǎn)通過使用小鼠腦圖譜來確定，確定目標(biāo)位點(diǎn)后，開始鉆孔，鉆孔使用顱骨鉆直徑為0.6mm。如將病毒注射在PVT腦區(qū)以及LSv腦區(qū)也進(jìn)行如上準(zhǔn)備工作，然后將微量注射器緩緩地插入aIC腦區(qū)、PVT腦區(qū)以及LSv腦區(qū)進(jìn)行病毒注射。

（4）前側(cè)島葉（aIC）病毒注射具體坐標(biāo)為：DV（dorsal-ventral，小鼠腦背側(cè)到腹側(cè)）：-3.2mm、AP（anterior-posterior，前端到后端）：+2.22mm、ML（medial-lateral，內(nèi)側(cè)到外側(cè)）：+2mm；丘腦室旁核（PVT）具體坐標(biāo)為：DV：-3mm、AP：-1.46mm、ML：+0.1mm；腹側(cè)外側(cè)隔核具體坐標(biāo)為：DV：-3.9mm、AP：+0.74mm、ML：+0.6mm。

（5）順行示蹤病毒：AAV-hSyn-EGFP，注射時(shí)采取5nl/min注射速度，注射總量為50nl；逆行示蹤病毒：rAAV-retro-EGFP，注射時(shí)同樣采取5nl/min注射速度，注射量也為50nl。在小鼠病毒注射完成后，微量注射器至少停針10min，待10min后，再緩緩地將微量注射器移出來，以防止病毒回流。

在體光纖記錄

實(shí)驗(yàn)人員在進(jìn)行在體光纖記錄實(shí)驗(yàn)前，首先需檢查和測試在體光纖的控制儀器運(yùn)行是否正常。將光纖線纜激光的接口端插入儀器的激發(fā)光源端，并旋轉(zhuǎn)使其緊密連接，然后開啟激光器，對(duì)光纖線電纜的出口進(jìn)行光強(qiáng)度的檢測和觀察，避免因部分殘缺導(dǎo)致光纖線中間漏光或接觸不良。完成設(shè)備的調(diào)試后，即可開始進(jìn)行光纖套管的插入工作。實(shí)驗(yàn)者先對(duì)小鼠進(jìn)行安撫，避免其受到應(yīng)激刺激，待小鼠的狀態(tài)穩(wěn)定后，將其放置于厚海綿墊上，用手指輕輕的按住小鼠的頭部，使其不能夠輕易的晃動(dòng)，用蘸有酒精的棉簽擦拭陶瓷光纖，使其保持清潔狀態(tài)，再將光纖線纜的末端輕輕旋轉(zhuǎn)使其能夠插入小鼠頭部外側(cè)的陶瓷插芯的尾端中，從而使激光光束能夠順利的通過插芯傳導(dǎo)到目標(biāo)區(qū)域處，最后將小鼠緩緩松開，輕放入五孔測試箱中，先讓其自由活動(dòng)5-10min,使其能夠適應(yīng)頭部攜帶的元件。

適應(yīng)結(jié)束后小鼠開始行為學(xué)測試，記錄小鼠在stage4階段的鈣信號(hào)，有30min的測試時(shí)間。每只小鼠完成行為學(xué)實(shí)驗(yàn)后，用75%的酒精擦拭設(shè)備箱，以免小鼠氣味和排泄物干擾下一只小鼠的測試。最后通過錄制的實(shí)驗(yàn)視頻確定小鼠四個(gè)動(dòng)作（正確、錯(cuò)誤、提前、遺漏）發(fā)生的時(shí)間點(diǎn)，再通過F-Scope軟件分析鈣信號(hào)的峰值變化。

小鼠5-CSRTT模型及評(píng)價(jià)

選用7-8周齡的雄性C57BL/6小鼠作為實(shí)驗(yàn)鼠，實(shí)驗(yàn)開始前進(jìn)行為期三天的環(huán)境適應(yīng)，再開始四個(gè)階段的適應(yīng)性訓(xùn)練，小鼠完成適應(yīng)性訓(xùn)練后，進(jìn)入到正式訓(xùn)練階段。此階段為難度遞進(jìn)式，SD的時(shí)間隨著訓(xùn)練減短，而ITI的時(shí)間隨著訓(xùn)練增長，參數(shù)的變化要求小鼠更高的注意力。此模型通過四個(gè)行為指標(biāo)來評(píng)價(jià)小鼠的注意力，為正確反應(yīng)、錯(cuò)誤反應(yīng)、過早反應(yīng)以及漏報(bào)。對(duì)完成5-CSRTT小鼠行為指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，隨著Stage的進(jìn)階，小鼠的正確次數(shù)變多，精確率也相應(yīng)地提升，而漏報(bào)沒有差異。表明成功構(gòu)建了小鼠5-CSRTT模型。

五項(xiàng)選擇連續(xù)反應(yīng)時(shí)任務(wù)（5-CSRTT）

A.5-CSRTT模型構(gòu)建時(shí)間軸。B.5-CSRTT任務(wù)的執(zhí)行過程。C.5-CSRTT行為學(xué)數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)。隨著stage的遞進(jìn)，正確次數(shù)增多，精確率提高，遺漏無差異

為了進(jìn)一步確認(rèn)aIC谷氨酸能神經(jīng)元與注意力之間的關(guān)系，使用在體光纖記錄法監(jiān)測小鼠的神經(jīng)元活動(dòng)，可以記錄小鼠行為時(shí)細(xì)胞內(nèi)鈣離子（Ca2+）瞬間的變化。在C57BL/6小鼠的aIC腦區(qū)單側(cè)注射AAV-CaMKII-GCaMP6s病毒，劑量為300nl，然后再通過手術(shù)將光纖套管植入在aIC上方，待病毒表達(dá)后，使用GCaMP6熒光鈣傳感器記錄aIC谷氨酸能神經(jīng)元群體的活動(dòng)。小鼠病毒注射后，使其休息一周，再開始5-CSRTT行為學(xué)訓(xùn)練。GCaMP6s的表達(dá)以及光纖位置的確定通過免疫熒光的方法進(jìn)行確認(rèn)。小鼠體內(nèi)鈣信號(hào)的測量在5-CSRTT任務(wù)中記錄，小鼠完成5-CSRTT訓(xùn)練后，且行為穩(wěn)定后，選擇stage4進(jìn)行在體光纖測試。根據(jù)5-CSRTT任務(wù)的行為指標(biāo)，將記錄的數(shù)據(jù)分為四組：正確反應(yīng)，錯(cuò)誤反應(yīng)，遺漏以及提前反應(yīng)。為了將aIC谷氨酸能神經(jīng)元活動(dòng)與行為指標(biāo)進(jìn)行時(shí)間的匹配，需將記錄的小鼠行為視頻與光纖測量系統(tǒng)同步。通過分析數(shù)據(jù)作者發(fā)現(xiàn)，與其他三組行為指標(biāo)相比，當(dāng)小鼠在5-CSRTT中響應(yīng)注意行為時(shí)，aIC中谷氨酸能神經(jīng)元鈣離子顯著升高，提示aIC谷氨酸能神經(jīng)元的活性顯著增加。當(dāng)小鼠響應(yīng)注意行為時(shí)面積明顯高于其他三組行為。小鼠aIC谷氨酸能神經(jīng)元響應(yīng)正確行為時(shí)鈣離子升高。

響應(yīng)注意行為時(shí)aIC谷氨酸能神經(jīng)元鈣信號(hào)激活增強(qiáng)

注意事項(xiàng)

動(dòng)物在訓(xùn)練過程中會(huì)獲得一定的獎(jiǎng)賞，因此在保證動(dòng)物正常的生理狀態(tài)下，需要控制動(dòng)物的飲食或飲水，以避免動(dòng)物因?yàn)轱柛苟鴾p少動(dòng)機(jī)行為，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因?yàn)閷?duì)于行為學(xué)實(shí)驗(yàn)來說，動(dòng)物保持一個(gè)良好的狀態(tài)很重要，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，動(dòng)物訓(xùn)練、測試和喂食的時(shí)間應(yīng)盡量保持一致。其次，應(yīng)保證同一只實(shí)驗(yàn)鼠的訓(xùn)練和測試的五孔設(shè)備箱為同一個(gè)，從而避免因?yàn)榄h(huán)境的微小變化對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。研究人員應(yīng)根據(jù)自己的課題合理化的設(shè)置訓(xùn)練參數(shù)和測試參數(shù)，統(tǒng)計(jì)方法尤其需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)類型來選擇。

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