2025 ESMO IO | Volrustomig機制添新證：PD-1錨定實現CTLA-4精準阻斷并誘導PD-1持續降解

前言

在腫瘤免疫治療領域，靶向程序性細胞死亡受體1（PD-1）/程序性死亡受體配體1（PD-L1）與靶向細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白-4（CTLA-4）的免疫治療聯合或不聯合化療已被證實相較化療能夠提升抗腫瘤療效1-3，但患者的長期OS獲益仍有限，亟需探索新的治療模式。Volrustomig是新型PD-1/CTLA-4雙特異性抗體，將一個抗PD-1單鏈可變區片段（scFv）與一個抗CTLA-4 scFv整合于同一抗體骨架，旨在通過優先結合于腫瘤微環境中已激活的PD-1+T細胞，從而在該細胞同步實現CTLA-4的高效阻斷4。2025年歐洲腫瘤內科學會免疫腫瘤學大會（ESMO IO）于12月10日至12日在英國倫敦召開。本次大會上公布了兩項臨床前研究（摘要號：288P與412P）結果，進一步揭示了Volrustomig的作用機制及臨床應用潛力5,6，為該藥物的臨床開發提供了新的實驗依據與理論支持。本文基于這兩項研究進行深入解讀，以供讀者參考。

288P：Volrustomig驅動強效的CTLA-4阻斷并誘導PD-1持續降解，增強體外T細胞功能

此前，在工程化細胞及超抗原刺激的外周血單個核細胞（PBMCs）的體外研究中觀察到，Volrustomig可通過結合PD-1錨定于T細胞表面，從而增強CTLA-4阻斷并可通過雙靶點共結合機制，誘導PD-1內吞降解。為進一步闡明Volrustomig的作用機制，研究人員繼續開展了系統的體外與離體實驗5。

Volrustomig可提升體外腫瘤浸潤淋巴細胞（TILs）干擾素γ（IFN-γ）的分泌水平

將胃癌來源的人腫瘤切片培養物（TSCs）以100nM的Volrustomig進行72小時孵育，隨后通過酶聯免疫吸附試驗（ELLA）檢測IFN-γ的分泌情況。同時，將非小細胞肺癌（NSCLC）來源的解離腫瘤細胞（DTCs）與100nM抗CTLA-4抗體、100nM抗PD-1抗體或不同濃度Volrustomig共培養72小時后，通過電化學發光技術（MSD）檢測IFN-γ的分泌。結果表明，Volrustomig可增強NSCLC DTCs及胃癌來源TSCs的IFN?γ分泌（圖1）5。

圖1. Volrustomig可增強NSCLC DTCs及胃癌來源TSCs的IFN?γ分泌

Volrustomig可在體外與離體條件下持續誘導PD?1降解

在NSCLC DTCs的離體模型中，將腫瘤組織解離后，分別使用Volrustomig或抗PD-1抗體與抗CTLA-4抗體的聯合制劑處理72-96小時，隨后通過流式細胞術對調節性T細胞（Tregs，CD4+/FOXP3+）、常規CD4+T細胞（CD4+/FOXP3-）以及CD8+T細胞進行總PD-1蛋白的定量分析。結果顯示，Volrustomig處理可導致CD8+T細胞、常規CD4+T細胞及Tregs表面的PD-1蛋白表達呈現劑量依賴性下降（圖2），且該降解效應在T細胞經歷多輪抗原再刺激后依然得以維持（圖4）。相比之下，聯合制劑未觀察到顯著的PD-1降解現象。值得注意的是，PD-1降解程度在不同細胞亞群中存在差異，其強度依次為Tregs>常規CD4+T細胞 > CD8+T細胞（圖3）5。

圖2. Volrustomig可在體外誘導NSCLC腫瘤TILs發生劑量依賴性PD-1降解，而抗CTLA-4抗體和抗PD-1抗體聯合制劑則無此作用

圖3. PD-1降解程度在Tregs中最強>常規CD4+T細胞 > CD8+T細胞[直方圖展示了在10nM Volrustomig及聯合制劑處理下的PD-1表達水平；相鄰點圖顯示了來自4個樣本的平均值±標準誤（非配對t檢驗）]

圖4. Volrustomig在體外和離體再刺激實驗中可誘導PD-1的持續降解[示意圖描述了再刺激實驗方案，并通過方差分析（ANOVA）評估了外周血單個核細胞（中圖）及基于樹突狀細胞（右圖）測定中的總PD-1表達水平]

Volrustomig在離體條件下優先結合表達PD?1的TILs

研究人員還對NSCLC與結直腸癌（CRC）來源的DTCs進行了AF488標記的Volrustomig染色與免疫表型分析。進一步的分析聚焦于CD4+與CD8+T細胞亞群，根據細胞表面PD-1與CTLA-4的共表達情況，將來自NSCLC與CRC DTCs的T細胞進行細分。數據顯示，在TILs中，PD-1與CTLA-4雙陽性亞群所表達的PD-1水平高于僅表達PD-1的亞群，從而導致Volrustomig在該群體中的結合更強（圖5）。此外，Volrustomig在TILs上的結合強度與PD-1的表達水平顯著相關，而與CTLA-4的表達無關（圖6）5。

圖5. 與PD-1+CTLA-4-TILs相比，PD-1+ CTLA-4+TILs表達更高水平的PD-1，從而導致更高的Volrustomig結合[通過對PD-1與CTLA-4表面表達進行設門，分選出NSCLC（紫色）和CRC（紅色）患者樹突狀細胞中的CD4+ T細胞與CD8+ T細胞，并繪制了PD-1及Volrustomig-AF488的平均熒光強度（MFI）（配對t檢驗）]

圖6. Volrustomig在TILs上的結合與PD?1顯著相關，而與CTLA?4不相關[圖為CRC樣本的代表性流式圖，展示了PD-1、CTLA-4的表達與Volrustomig-AF488結合情況之間的相關性，相關系數基于6個樣本計算得出（Pearson相關系數）]

Volrustomig可協同結合TILs上的CTLA?4，與抗PD-1抗體與抗CTLA-4抗體的聯合制劑相比，可提供更高的CTLA?4受體占位率

受體占據分析表明，在NSCLC DTCs中，經Volrustomig或抗PD-1與抗CTLA-4聯合制劑處理30分鐘后，采用熒光標記的競爭性抗體檢測并利用流式細胞術定量測定Tregs、常規CD4+T細胞及CD8+T細胞表面的“游離”PD-1與CTLA-4水平。結果顯示，相較于抗PD-1抗體與抗CTLA-4抗體聯合制劑，Volrustomig在Tregs、CD4+及CD8+T細胞上均能實現更低的“游離”CTLA-4水平，展現出更優的CTLA-4通路阻斷效能5。

圖7. Volrustomig與TILs上的CTLA-4協同結合[滴定曲線展示了一個代表性樣本的技術重復結果，IC50數據基于4個樣本得出（配對t檢驗）]

以上發現共同說明，Volrustomig作為一種同時靶向PD-1與CTLA-4的雙特異性抗體，通過PD-1介導的錨定作用，優先結合于TILs表面，而后協同結合CTLA-4。這一靶向特性不僅能夠誘導TILs上的PD-1發生降解，且與抗PD-1/抗CTLA-4單抗聯合療法相比，可誘導更強的CTLA-4阻斷效應，為其臨床轉化提供了理論支撐。

412P：Volrustomig協同結合PD-1與CTLA-4，并在腫瘤抗原特異性T細胞中誘導PD-1降解

為在更貼近生理環境的腫瘤抗原特異性場景中驗證Volrustomig的作用機制，本研究從健康供體PBMCs中誘導生成黑色素瘤相關抗原1（MART1）特異性T細胞，構建腫瘤抗原特異性模型。利用熒光標記的Volrustomig及競爭性抗CTLA-4抗體，通過流式細胞術分析了PD-1表達對其結合及CTLA-4阻斷功能的影響；采用Incucyte活細胞成像系統評估了抗原特異性殺傷效率，并輔以細胞因子檢測以全面評價T細胞功能變化；此外，通過蛋白質印跡與流式細胞術從蛋白水平檢測了PD-1的降解情況6。

Volrustomig在抗原特異性T細胞上以PD?1為錨定，并協同結合CTLA?4

流式細胞術分析評估了Volrustomig與預阻斷PD-1或CTLA-4的MART1特異性擴增T細胞的結合情況，結果顯示，當PD-1被阻斷時，Volrustomig的結合減少，而CTLA-4的阻斷則對其結合無影響，表明Volrustomig主要通過錨定PD-1來發揮作用（圖8）6。

圖8. 流式細胞術評估Volrustomig與PD-1或 CTLA -4預阻斷的MART-1擴增T細胞的結合情況[通過Dextramer染色法鑒定抗原特異性CD8+T細胞（CD8 DEX+），經預阻斷的實驗組數據以未阻斷T細胞為基準進行歸一化，并以倍數變化表示；樣本量N=4，采用配對單因素方差分析進行統計檢驗，統計顯著性標注如下：* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.005]

進一步的功能分析顯示，當PD-1未被阻斷時，Volrustomig能更有效地阻斷表面CTLA-4的表達，強調了PD-1在Volrustomig介導的CTLA-4阻斷中的關鍵作用（圖9）6。

圖9. 流式細胞術評估Volrustomig對PD-1預阻斷或未阻斷的MART1擴增T細胞中CTLA-4的阻斷作用[對4名健康供體的MART-1擴增T細胞進行預處理：一組使用a-PD-1抗體（綠色標記），另一組不作處理（藍色標記），并通過流式細胞術檢測Volrustomig介導的CTLA-4阻斷效果；采用Dextramer染色法鑒定抗原特異性CD8+T細胞（DEX）；CTLA-4表面減少百分比通過Volrustomig處理的MART-1擴增T細胞計算得出。樣本量N=4，采用配對單因素方差分析，*p<0.05，**p<0.01]

Volrustomig與PD?1的結合對于增強抗原特異性殺傷活性至關重要

抗原特異性殺傷效率評估實驗觀察到，預先阻斷PD-1會減弱Volrustomig對抗原特異性殺傷的增強作用，并降低IFN-γ和顆粒酶B的釋放，進一步證實了PD-1在Volrustomig功能機制中的重要性（圖10）6。

圖10. Volrustomig阻斷PD-1對靶向殺傷及細胞因子釋放的功能增強作用分析[從4名健康供體獲取的MART-1擴增T細胞，經a-PD-1預先阻斷（綠色）或不做處理（藍色），隨后與自體單核細胞及表達MART-1-GFP的腫瘤細胞進行共培養；通過Incucyte系統動態監測GFP信號減弱以評估抗原特異性殺傷效應，并收集上清液進行細胞因子檢測；以未經阻斷的T細胞為基準進行標準化，計算預處理組數據的倍數變化。實驗獨立重復4次，采用配對單因素方差分析，* p<0.05]

與抗PD-1抗體及抗PD-1抗體與抗CTLA-4抗體聯合制劑相比，Volrustomig可通過在抗原特異性T細胞上協同結合PD?1與CTLA?4，誘導PD?1降解

進一步研究發現，在抗原特異性模型體系中，與抗PD-1抗體及抗PD-1抗體與抗CTLA-4抗體聯合制劑相比，Volrustomig能夠協同結合T細胞上的PD-1與CTLA-4，并介導PD-1的降解，但不影響CTLA-4的表達。該結論已通過蛋白質印跡（圖11）與流式細胞術（圖12）得到證實6。

圖11. 蛋白質印跡法（Western blot）評估Volrustomig介導的PD-1降解作用[將4名健康供體的MART-1擴增T細胞與MART-1肽（5μg/mL）及腫瘤細胞共培養；培養物分別經抗PD-1抗體、抗PD-1抗體與抗CTLA-4抗體聯合制劑或Volrustomig處理；收集T細胞裂解液用于總PD-1評估。Western blot結果代表2名供體的樣本結果]

圖12. 流式細胞術評估Volrustomig介導的PD-1降解作用[將4名健康供體的MART-1擴增T細胞與MART1肽（5μg/mL）及腫瘤細胞共培養；通過流式細胞術定量檢測細胞內PD-1和CTLA-4水平；細胞內PD-1的倍數變化值以未處理T細胞為基準進行歸一化計算。樣本量N=4，配對單因素方差分析*p<0.05，**p<0.01]

綜上所述，本研究在人類抗原特異性免疫模型中進一步證實了Volrustomig通過PD-1錨定協同結合CTLA-4以增強CTLA-4阻斷的功能機制，并闡明了該機制在促進T細胞抗原特異性殺傷與細胞因子釋放中的關鍵作用。尤其重要的是，研究揭示了Volrustomig特有的PD-1降解能力，這進一步從作用機制上將其與傳統的抗CTLA-4/抗PD-1抗體或二者聯合方案區分開來，為其在臨床開發中的差異化價值提供了關鍵臨床前依據。

總結及展望

上述證據共同表明，Volrustomig憑借其獨特的PD-1/CTLA-4雙特異性結構，通過“PD-1錨定”機制在腫瘤微環境中實現CTLA-4的高效選擇性阻斷，并誘導PD-1持續降解。這一作用機制的臨床轉化前景已獲得初步研究數據的支持。在晚期非鱗NSCLC一線治療中，一項Ib/II期研究顯示（NCT03530397），Volrustomig聯合化療相比帕博利珠單抗聯合化療，延長了中位緩解持續時間（20.5個月 vs 9.9個月），并在PD-L1＜1%的患者中表現出更高的客觀緩解率（ORR，55.6% vs 44.4%）7。2024年世界肺癌大會(WCLC)上公布的數據顯示，Volrustomig聯合化療在非鱗狀細胞癌(n=119)和鱗狀細胞癌(n=20)隊列的ORR分別為43.7%和65.0%，疾病控制率（DCR）分別為84.9%和95.0%8。目前，針對該藥物的多項關鍵III期臨床試驗，包括eVOLVE-Lung02、eVOLVE-HNSCC及eVOLVE-Meso等已全面展開，旨在進一步評估該藥物在肺癌、頭頸部鱗狀細胞癌及惡性胸膜間皮瘤等多種實體瘤中的療效與安全性。展望未來，隨著這些關鍵臨床試驗數據的披露，Volrustomig有望為腫瘤免疫治療提供一種新的雙特異性抗體療法，并為該類藥物的研發與臨床應用確立新的方向。

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排版：Zelda

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