張澤民院士經(jīng)典綜述！單細(xì)胞測(cè)序下的腫瘤免疫治療！

免疫浸潤(rùn)是一整套知識(shí)體系，是一種邏輯思維的方式，一旦擁有這種嶄新的角度，作為醫(yī)生，我們將能從更深刻地維度去認(rèn)識(shí)腫瘤，去診治病人。我們有幸讀到一篇免疫浸潤(rùn)的綜述，內(nèi)容系統(tǒng)，思路條理，邏輯層層遞進(jìn)，非常值得果友們學(xué)習(xí)；更幸運(yùn)的是，果友們積極參與綜述翻譯，并順利完成任務(wù)。感謝果友們的支持和參與。這篇論文是多位果友參與完成，愿果友們反復(fù)閱讀，仔細(xì)推敲琢磨，留言討論，或查閱參考文獻(xiàn)。如果您覺得翻譯得好，受益匪淺，也可以打賞（感謝果友支持），所有收益將分發(fā)至參與翻譯的果友們！再次感謝果友們。

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根據(jù)綜述主要內(nèi)容，我們將綜述分為上篇——免疫治療和下篇——免疫浸潤(rùn)。對(duì)于從事腫瘤臨床診治和研究的醫(yī)生來說，盡管這篇綜述對(duì)于腫瘤免疫的基礎(chǔ)知識(shí)涉及不多，但是高屋建瓴地提供認(rèn)識(shí)腫瘤免疫的路徑。腫瘤免疫基礎(chǔ)知識(shí)我們會(huì)通過PPT（免費(fèi)）和視頻（收費(fèi)）形式在公眾號(hào)分享。請(qǐng)果友們多多關(guān)注。

綜述論文 OPEN

腫瘤免疫治療歷史與進(jìn)展：腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的特征其治療意義

張媛媛和 張澤民

免疫治療使腫瘤治療發(fā)生革命性改變，并使腫瘤免疫煥發(fā)出新活力。多種免疫治療方法，如過繼細(xì)胞移植治療（ACT）和免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICIs）已經(jīng)獲得持久的臨床反應(yīng)，但其療效迥異，且只有部分腫瘤患者獲益。腫瘤微環(huán)境（TME）中的免疫浸潤(rùn)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并影響腫瘤患者的臨床預(yù)后。全面剖析腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞有助于闡明腫瘤-免疫逃逸的機(jī)制，從而為開發(fā)新的治療策略提供機(jī)遇。然而，腫瘤微環(huán)境的高度異質(zhì)性和可變性阻礙了對(duì)腫瘤內(nèi)免疫細(xì)胞的準(zhǔn)確分離。隨著單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）和質(zhì)譜流式細(xì)胞技術(shù)等單細(xì)胞技術(shù)的最新進(jìn)展，使得系統(tǒng)地分析腫瘤微環(huán)境成為可能，并為解析腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的功能多樣性提供機(jī)會(huì)。本文綜述了腫瘤免疫治療的最新進(jìn)展，重點(diǎn)介紹具有里程碑意義的研究和腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞的單細(xì)胞特性，并總結(jié)腫瘤內(nèi)免疫細(xì)胞的表型多樣性及其與腫瘤免疫治療的關(guān)系。本文可以加深我們對(duì)腫瘤免疫治療進(jìn)展的了解，有助于闡明免疫細(xì)胞在腫瘤進(jìn)展中的調(diào)控作用，并為腫瘤治療開發(fā)新型免疫治療方法提供指導(dǎo)。

關(guān)鍵詞：免疫治療；腫瘤微環(huán)境；單細(xì)胞技術(shù)；腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞；表型多樣性

Cellular & Molecular Immunology (2020) 17:807–821; https://doi.org/10.1038/s41423-020-0488-6

引言

腫瘤是一種基因組疾病，其特點(diǎn)是基因組不穩(wěn)定，在腫瘤發(fā)展過程中會(huì)出現(xiàn)大量點(diǎn)突變積累和結(jié)構(gòu)改變 1,2 。基因組學(xué)變化引起腫瘤抗原產(chǎn)生，而這些抗原會(huì)被免疫系統(tǒng)識(shí)別為非自身來源，并觸發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng) 3,4 。免疫系統(tǒng)之所以在免疫監(jiān)視中發(fā)揮重要的作用 4,5，是因?yàn)檫m應(yīng)性和先天性免疫系統(tǒng)的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)到腫瘤微環(huán)境（TME）以調(diào)控腫瘤進(jìn)展 6,7 。固有免疫細(xì)胞由自然殺傷細(xì)胞（NK cell）、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和吞噬細(xì)胞（包括肥大細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞 （DC））組成，通過直接殺傷腫瘤細(xì)胞或觸發(fā)適應(yīng)性免疫反應(yīng)參與腫瘤抑制 8–10。適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的功能依賴于淋巴細(xì)胞（B細(xì)胞和T細(xì)胞），其中B細(xì)胞在體液免疫反應(yīng)中起主要作用，而T細(xì)胞則參與細(xì)胞免疫反應(yīng) 5,11,12。

有效的免疫應(yīng)答既可以消滅腫瘤細(xì)胞，也可以損害腫瘤細(xì)胞的表型和功能 3。然而，腫瘤細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)化出多種機(jī)制以逃脫免疫監(jiān)視，如抗原提呈機(jī)制缺陷、上調(diào)負(fù)調(diào)控通路、招募抑制性免疫細(xì)胞亞群 13–17，從而導(dǎo)致免疫細(xì)胞效應(yīng)功能受阻，抗腫瘤免疫應(yīng)答喪失。

免疫治療旨在增強(qiáng)固有防御以消除腫瘤細(xì)胞，是腫瘤治療的重大突破，并已革新腫瘤學(xué)領(lǐng)域。雖然釋放宿主免疫系統(tǒng)來根除腫瘤的想法可追溯到一個(gè)世紀(jì)前 18,19，但直到近期才在基礎(chǔ)和臨床研究上取得重大進(jìn)展。多種腫瘤對(duì)免疫治療有持久臨床反應(yīng) 20–25，盡管應(yīng)答率有限，且其潛在機(jī)制不明 26。免疫細(xì)胞是免疫治療的基礎(chǔ)；因此，了解腫瘤微環(huán)境中的免疫浸潤(rùn)是腫瘤治療中提高反應(yīng)率和開發(fā)新型免疫治療策略的關(guān)鍵。雖然腫瘤免疫的“生態(tài)系統(tǒng)”高度復(fù)雜并由多種細(xì)胞組成，但是單細(xì)胞技術(shù)已成為解析腫瘤微環(huán)境的有力工具 27。盡管已經(jīng)投入大量精力研究T細(xì)胞特性，但是固有和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的其他免疫細(xì)胞，包括樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和B細(xì)胞，也影響腫瘤進(jìn)展和免疫治療的反應(yīng)。在本文中，我們將概述腫瘤免疫治療的主要分類與發(fā)展歷史，腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞在人類腫瘤的最新研究結(jié)果及其與免疫治療的關(guān)系和潛在臨床應(yīng)用。

圖1.免疫治療的主要種類。在臨床實(shí)踐中發(fā)展起來、具有廣闊前景的腫瘤免疫免疫治療形式包括：溶瘤病毒治療、腫瘤疫苗、細(xì)胞因子治療、過繼細(xì)胞移植免疫治療和免疫檢查點(diǎn)抑制。本文描述每種治療的基本原理及每步所涉及的細(xì)胞和分子基礎(chǔ)。（注：DCs，樹突狀細(xì)胞；NK，自然殺傷細(xì)胞；TCR，T細(xì)胞受體；CAT-T嵌合抗原受體T細(xì)胞）

免疫治療的主要種類

我們簡(jiǎn)要回顧已用于腫瘤治療的免疫治療的既往研究。這些研究促進(jìn)主要幾類免疫治療的發(fā)展。（圖1）

溶瘤病毒治療

一個(gè)多世紀(jì)以來，傳統(tǒng)免疫治療利用細(xì)菌或病毒感染來增強(qiáng)免疫應(yīng)答。早在1863年，Virchow觀察到腫瘤組織總是伴隨著免疫系統(tǒng)的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，首次發(fā)現(xiàn)腫瘤和炎癥之間的聯(lián)系。最早的腫瘤免疫治療病例能追溯到1891年，免疫治療之父--William Coley，首次嘗試?yán)妹庖呦到y(tǒng)治療腫瘤，觀察到活的和滅活化膿性鏈球菌和沙雷氏菌可能導(dǎo)致肉瘤患者的腫瘤消退。雖然這種前衛(wèi)的治療策略為利用免疫系統(tǒng)治療腫瘤提供一種驗(yàn)證性概念，但其作用機(jī)制及感染風(fēng)險(xiǎn)尚不明確。數(shù)十年后，溶瘤病毒治療被發(fā)現(xiàn)，該方法利用轉(zhuǎn)基因病毒感染腫瘤細(xì)胞，從而刺激產(chǎn)生促炎環(huán)境，增強(qiáng)全身性抗腫瘤免疫。隨著基因工程和病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)的進(jìn)步，溶瘤病毒治療近些年已經(jīng)取得巨大進(jìn)步。特別是talimogene laherparepvec（T-Vec，別名Imlygic），它是一種基因修飾的I型單純皰疹病毒，對(duì)晚期黑色素瘤患者的臨床療效很好，并已被批準(zhǔn)用于治療不可切除的轉(zhuǎn)移性黑色素瘤。

腫瘤疫苗

腫瘤疫苗利用腫瘤特異性抗原激活T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫應(yīng)答。之前報(bào)道的一項(xiàng)關(guān)鍵研究證實(shí)，MZ2-E和MZ2-D能被T細(xì)胞識(shí)別而激活免疫應(yīng)答，MZ2-E和MZ2-D都是MAGE（黑色素瘤相關(guān)抗原）基因家族編碼的抗原。同時(shí)，在黑色素瘤患者體內(nèi)腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TILs）介導(dǎo)的免疫應(yīng)答反應(yīng)中，另一人類黑色素瘤抗原--gp100，被證明與腫瘤抑制相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)為腫瘤免疫治療中利用腫瘤抗原作為疫苗奠定理論基礎(chǔ)。除了腫瘤抗原，基于樹突狀細(xì)胞的疫苗也展示出顯著的臨床效果。樹突狀細(xì)胞是抗原提呈能力最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞（APC），在活化抗腫瘤免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用。具體來說，腫瘤抗原激活的樹突狀細(xì)胞能內(nèi)化、加工處理抗原，并將加工的表位提呈給T細(xì)胞，從而誘導(dǎo)毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）免疫應(yīng)答。由于樹突狀細(xì)胞在抗原提呈中的主要作用，因而在基于樹突狀細(xì)胞的疫苗中得到應(yīng)用，其中涉及用分離到負(fù)載有腫瘤抗原或腫瘤細(xì)胞裂解物的樹突狀細(xì)胞，這些樹突狀細(xì)胞經(jīng)體外確定成熟的雞尾酒抗原刺激后再回輸至患者體內(nèi)。其中典型的例子是sipuleucel-T，該疫苗是基于樹突狀細(xì)胞的免疫治療并已被批準(zhǔn)用于晚期前列腺癌的治療。此外，完整腫瘤細(xì)胞也可以用來激活自發(fā)免疫應(yīng)答。GVAX是一種自體腫瘤細(xì)胞經(jīng)基因修飾后分泌粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的腫瘤疫苗，已在多種腫瘤類型中顯示出增強(qiáng)腫瘤特異性免疫應(yīng)答的潛力。這些進(jìn)展強(qiáng)調(diào)腫瘤疫苗在腫瘤治療臨床應(yīng)用中的重要性。

細(xì)胞因子

細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞分泌以應(yīng)對(duì)細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激狀態(tài)如感染、炎癥和腫瘤的發(fā)生，其功能是作為調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)細(xì)胞內(nèi)相互作用以及溝通的信號(hào)。分泌型細(xì)胞因子能夠以復(fù)雜而高效的方式快速傳遞免疫信號(hào)，從而對(duì)靶抗原產(chǎn)生強(qiáng)有力的協(xié)同免疫應(yīng)答。 細(xì)胞因子在腫瘤治療中的潛在應(yīng)用獲益于1976年對(duì)白細(xì)胞介素2（IL-2）的認(rèn)識(shí)。 IL-2最初被命名為T細(xì)胞生長(zhǎng)因子，在體內(nèi)、外都具有促進(jìn)T細(xì)胞增殖的能力，從而發(fā)揮免疫刺激作用。 一個(gè)典型的細(xì)胞因子治療案例是，在轉(zhuǎn)移性腫瘤患者中大劑量應(yīng)用IL-2可使腫瘤明顯消退。除IL-2外，在腫瘤治療中，干擾素-α（IFN-α）也是一種經(jīng)典細(xì)胞因子治療。干擾素家族（IFNs）由大量細(xì)胞因子組成，其中屬于I型干擾素的IFN-α是多效能細(xì)胞因子，是決定抗腫瘤免疫效果的關(guān)鍵因子。IFN-α在腫瘤控制中發(fā)揮多種角色，包括通過誘導(dǎo)細(xì)胞衰老和凋亡直接消滅腫瘤細(xì)胞，通過刺激樹突狀細(xì)胞成熟和增強(qiáng)T細(xì)胞的細(xì)胞毒性而促進(jìn)有效的抗腫瘤免疫應(yīng)答。 臨床研究已經(jīng)證實(shí)高劑量IFN-α對(duì)慢性髓系白血病和黑色素瘤的治療作用。盡管這些細(xì)胞因子具有臨床益處，但耐受性差和毒副作用嚴(yán)重，使得細(xì)胞因子作為單一治療的進(jìn)一步應(yīng)用受阻。不過，細(xì)胞因子與其他免疫治療如過繼細(xì)胞移植（ACT）聯(lián)合應(yīng)用仍在研究中，以規(guī)避細(xì)胞因子治療的嚴(yán)重不良反應(yīng)。

過繼細(xì)胞移植

過繼細(xì)胞移植（Adoptive cell transfer ACT）治療使用自體免疫細(xì)胞，特別是T細(xì)胞。這些細(xì)胞經(jīng)過分離或基因工程改造，體外擴(kuò)增，之后重新輸入患者體內(nèi)以消滅癌細(xì)胞。過繼細(xì)胞移植治療已顯示出持續(xù)的臨床療效。Rosenberg等證明向轉(zhuǎn)移性腫瘤患者施用大劑量IL-2并聯(lián)合輸注自體淋巴因子激活殺傷細(xì)胞的治療是有效的。在首次成功過繼免疫治療試驗(yàn)之后，研究小組隨后使用腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TILs）改進(jìn)這種方法，并證明IL-2擴(kuò)增的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移顯示出更強(qiáng)的治療效果。這些研究為使用腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞治療晚期人類腫瘤提供了理論依據(jù)。

此后發(fā)現(xiàn)，將針對(duì)過度表達(dá)、自身衍生分化抗原的高選擇性腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞過繼移植輸注給轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者，可導(dǎo)致腫瘤患者T細(xì)胞持續(xù)性克隆再增殖。以上做法提示，在過繼轉(zhuǎn)移中可使用針對(duì)特定新抗原的基因修飾T細(xì)胞。當(dāng)前，已經(jīng)發(fā)明了兩種類型的基因修飾T細(xì)胞，即嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor, CAR）T細(xì)胞和T細(xì)胞受體（T-cell receptor, TCR）工程改造的T細(xì)胞用于過繼移植，并已經(jīng)在惡性腫瘤治療方面取得實(shí)質(zhì)性進(jìn)展。

CAR-T細(xì)胞治療利用抗體片段來識(shí)別在癌細(xì)胞表面表達(dá)的特定抗原。第一代CAR-T細(xì)胞是通過表達(dá)免疫球蛋白-TCR嵌合分子作為功能性受體，具有抗體特異性的基因修飾T細(xì)胞。然而，這些CAR-T細(xì)胞直到1998年才能夠在體內(nèi)持續(xù)存在。當(dāng)時(shí)Maher等通過將CD28等共刺激分子引入到基因工程化CARs中，建立了新一代CAR-T細(xì)胞，使基因修飾T細(xì)胞能夠在體內(nèi)持續(xù)存在并保持活性。隨后，他們證明CD19特異、CD28 / CD3-zeta雙重信號(hào)CAR修飾T細(xì)胞可以誘導(dǎo)成人急性淋巴細(xì)胞白血病的分子緩解。此外，還研究了其他分子與CAR偶聯(lián)時(shí)的功效。Porter等改造自體T細(xì)胞，使其表達(dá)與CD3-zeta和4–1BB信號(hào)域連接的抗CD19分子，用其靶向B細(xì)胞抗原CD19，發(fā)現(xiàn)這些被遺傳修飾的自體T細(xì)胞可在慢性淋巴細(xì)胞白血病（CLL）患者中產(chǎn)生強(qiáng)有力的CD19特異性免疫應(yīng)答。這些發(fā)現(xiàn)揭示了CAR-T治療在人類腫瘤治療中的良好前景。Clay等首先報(bào)道用TCR工程改造的T細(xì)胞或TCR-T治療方法。他們證明將TCR基因轉(zhuǎn)移到黑色素瘤患者的外周血淋巴細(xì)胞（PBL）中可以產(chǎn)生具有抗腫瘤反應(yīng)性的效應(yīng)T細(xì)胞。隨后，當(dāng)用TCR工程化T細(xì)胞治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者時(shí)，這種治療的臨床潛力得到證實(shí)。

值得注意的是，在腫瘤細(xì)胞中異常表達(dá)的典型腫瘤-睪丸抗原NY-ESO-1，已被轉(zhuǎn)基因TCR-T細(xì)胞靶向，介導(dǎo)持續(xù)的抗原特異性抗腫瘤作用，最終導(dǎo)致腫瘤退縮。因此，CAR-T細(xì)胞治療和TCR-T細(xì)胞治療都在腫瘤治療方面取得實(shí)質(zhì)性進(jìn)展，并已取得令人鼓舞的臨床效果。

免疫檢查點(diǎn)抑制劑

盡管過繼細(xì)胞移植治療取得巨大進(jìn)展，但一類新型的單克隆抗體（monoclonal antibodies, mAbs）即免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICIs），現(xiàn)已進(jìn)入醫(yī)學(xué)實(shí)踐，并成為最重要的免疫治療方法之一。免疫檢查點(diǎn)分子即共抑制信號(hào)傳導(dǎo)途徑的分子，其作用是維持免疫耐受，但經(jīng)常被癌細(xì)胞利用以逃避免疫監(jiān)視。免疫檢查點(diǎn)抑制劑旨在通過阻斷共抑制信號(hào)通路來恢復(fù)抗腫瘤免疫反應(yīng)，并促進(jìn)免疫介導(dǎo)的惡性細(xì)胞清除。其最廣泛使用的靶點(diǎn)是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)分子4（CTLA-4）、程序性細(xì)胞死亡受體1（PD-1）和程序性細(xì)胞死亡配體-1（PD-L1）。

CTLA-4是一種在T細(xì)胞上表達(dá)的共抑制分子，具有負(fù)調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化的功能。一項(xiàng)開創(chuàng)性研究表明，用抗體阻斷CTLA-4可以誘導(dǎo)有效的免疫反應(yīng)并導(dǎo)致腫瘤消退，開啟了用抗體給免疫細(xì)胞”松開剎車”來增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)的時(shí)代。經(jīng)臨床試驗(yàn)和療效評(píng)估后，CTLA-4單抗ipilimumab以其增強(qiáng)T細(xì)胞活化和持續(xù)誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的能力，成為首個(gè)被批準(zhǔn)用于腫瘤治療的免疫檢查點(diǎn)抑制劑。同時(shí)，PD-1被發(fā)現(xiàn)在T細(xì)胞表面表達(dá)，最初被認(rèn)為參與程序性細(xì)胞死亡，后來證明PD-1是免疫反應(yīng)的負(fù)調(diào)節(jié)分子。然而，PD-1的調(diào)節(jié)機(jī)制在其配體PD-L1的發(fā)現(xiàn)之前仍然是難以捉摸的。PD-L1在正常組織中表達(dá)，當(dāng)與PD-1結(jié)合時(shí)，通過抑制TCR介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌來調(diào)節(jié)免疫耐受。然而，腫瘤細(xì)胞也異常表達(dá)PD-L1以逃避免疫監(jiān)視。研究表明，抑制PD-1或PD-L1可以恢復(fù)T細(xì)胞的細(xì)胞毒性能力并誘導(dǎo)腫瘤消退，提示PD-1或PD-L1可以作為治療靶點(diǎn)。事實(shí)上，阻斷PD-1通路已取得顯著的臨床效果，靶向PD-1或PD-L1的抗體已被批準(zhǔn)用于治療多種腫瘤 。

該綜述下篇主要是腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的總結(jié)，是我們關(guān)注的核心。

腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞及其與免疫治療的關(guān)系

腫瘤免疫治療，如細(xì)胞過繼轉(zhuǎn)移和腫瘤免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療的成功，已經(jīng)證明免疫細(xì)胞，特別是T細(xì)胞，可以用來消除腫瘤細(xì)胞。盡管免疫治療有持續(xù)的臨床療效，但只有一小部分腫瘤患者從中受益。作為腫瘤微環(huán)境的主要組成部分，免疫浸潤(rùn)已被證實(shí)有助于腫瘤進(jìn)展和免疫治療反應(yīng)。因此，更好地理解腫瘤微環(huán)境中的固有免疫細(xì)胞和適應(yīng)性免疫細(xì)胞對(duì)于破譯免疫治療機(jī)制、定義預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物和識(shí)別新的治療靶點(diǎn)至關(guān)重要。

注：無論是基礎(chǔ)研究還是生信分析，免疫浸潤(rùn)細(xì)胞一般包括6種細(xì)胞，T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞（俗稱TBNK），樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞（統(tǒng)稱髓系細(xì)胞）。

T細(xì)胞

因具有強(qiáng)效的腫瘤殺傷能力，T細(xì)胞成為腫瘤免疫的焦點(diǎn)。T細(xì)胞通過主要組織相容性復(fù)合物（major histocompatibility complex, MHC）分子或人類白細(xì)胞抗原呈遞的腫瘤抗原短肽與T細(xì)胞受體（TCR）反應(yīng)而發(fā)揮作用。T細(xì)胞受體由大量TCR基因片段隨機(jī)重組的基因重排產(chǎn)生，其過程可能產(chǎn)生各種T細(xì)胞受體組成成分，賦予T細(xì)胞多樣性和特異性。腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞在有效抗腫瘤免疫中起關(guān)鍵作用，并且不同類型T細(xì)胞，包括細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL），輔助性T細(xì)胞（T）和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs），均參與腫瘤微環(huán)境內(nèi)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。

細(xì)胞毒性T細(xì)胞是關(guān)鍵的效應(yīng)細(xì)胞，可與細(xì)胞毒性分子，如顆粒酶和穿孔素，一起發(fā)揮功能。研究表明，腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞，特別是細(xì)胞毒性T細(xì)胞的存在，與多種癌癥患者存活呈正相關(guān)。但是，由于腫瘤微環(huán)境的免疫抑制導(dǎo)致其耗竭或功能失調(diào)，腫瘤部位浸潤(rùn)的細(xì)胞毒性T細(xì)胞往往不能控制腫瘤生長(zhǎng)。T細(xì)胞耗竭的特征是PD-1和其它抑制分子上調(diào)，最初在慢性淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒感染的小鼠模型中報(bào)道，并證明在人類癌癥中普遍存在。例如，Thommen等對(duì)非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者中PD-1表達(dá)水平不同的三群瘤內(nèi)CD8腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞亞群的特性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)PD-1高表達(dá)的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞已耗竭，但可預(yù)測(cè)非小細(xì)胞肺癌患者對(duì)PD-1抗體治療的反應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)及免疫檢查點(diǎn)抑制劑深入人心的臨床療效突顯了干預(yù)T細(xì)胞功能異常在腫瘤治療中的重要性。

CD4 T細(xì)胞包含輔助性細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞。輔助性T細(xì)胞通過幫助CD8效應(yīng)T細(xì)胞或通過充當(dāng)細(xì)胞毒性T細(xì)胞來直接消除腫瘤細(xì)胞而有助于抗腫瘤免疫。與此相反，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)于維持穩(wěn)態(tài)必不可少，通過可溶性免疫抑制因子直接破壞T細(xì)胞功能，以及CTLA-4介導(dǎo)的抑制抗原呈遞細(xì)胞共刺激信號(hào)間接阻止T細(xì)胞活化，從而協(xié)調(diào)抗腫瘤免疫。值得注意的是，抗CTLA-4抗體不僅可以阻斷負(fù)調(diào)節(jié)信號(hào)通路來加強(qiáng)T細(xì)胞反應(yīng)，也可誘導(dǎo)Treg耗盡，表明免疫檢查點(diǎn)抑制劑在抗腫瘤免疫中作用機(jī)制復(fù)雜。

B細(xì)胞

B細(xì)胞是在適應(yīng)性免疫系統(tǒng)體液免疫中起作用的體液免疫細(xì)胞。在被感染細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的刺激下，B細(xì)胞分化為記憶B細(xì)胞或漿細(xì)胞，后者可分泌免疫球蛋白（Igs，也稱為抗體）以結(jié)合并中和靶抗原。值得注意的是，B細(xì)胞激活涉及抗原與B細(xì)胞受體（BCR）相互作用。BCR是膜結(jié)合形式的Ig（mIg），賦予B細(xì)胞抗原特異性。每個(gè)B細(xì)胞都具有獨(dú)特的BCR，該BCR源自Ig基因片段隨機(jī)重排產(chǎn)生的高度多樣化的BCR基因庫。BCR基因庫具有不同的抗原特異性，當(dāng)遇到抗原時(shí)，可以通過生發(fā)中心的類型轉(zhuǎn)換重組和體細(xì)胞超突變進(jìn)一步修飾所選擇的BCR，從而獲得針對(duì)靶抗原的最佳抗體。

B細(xì)胞不僅通過產(chǎn)生的抗體在體液免疫中起著至關(guān)重要的作用，而且還通過充當(dāng)抗原呈遞細(xì)胞來增強(qiáng)T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，或通過細(xì)胞因子或調(diào)節(jié)性B細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，參與細(xì)胞免疫。此外，B細(xì)胞在慢性炎癥和腫瘤部位輔助維持二級(jí)淋巴器官結(jié)構(gòu)和促進(jìn)三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)（TLSs）形成。三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)是免疫細(xì)胞，如T細(xì)胞、B細(xì)胞和濾泡樹突狀細(xì)胞聚集的高級(jí)有序結(jié)構(gòu)。三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)對(duì)于B細(xì)胞和T細(xì)胞募集和局部激活特別重要，因此有助于長(zhǎng)期免疫。

由于在體液和細(xì)胞免疫中的多功能性， B細(xì)胞在抗腫瘤免疫中表現(xiàn)出表型多樣性。研究表明，腫瘤浸潤(rùn)B細(xì)胞（Tumor-infiltrating B cells，TIB）通過分泌可溶性因子促進(jìn)髓樣細(xì)胞促血管生成和促腫瘤功能，或通過產(chǎn)生促進(jìn)腫瘤細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的因子來抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。然而，與促腫瘤作用相反的是，越來越多研究表明B細(xì)胞具有抗腫瘤免疫功能，并可能有利于患者預(yù)后。研究證明，CD20 腫瘤浸潤(rùn)B細(xì)胞與非小細(xì)胞肺癌和卵巢癌患者的預(yù)后良好相關(guān)，機(jī)制可能是充當(dāng)抗原呈遞細(xì)胞來增強(qiáng)細(xì)胞毒性T細(xì)胞反應(yīng)。值得注意的是，Cabrita等發(fā)現(xiàn)，三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)形成以及腫瘤中CD20 B細(xì)胞和CD8 T細(xì)胞同時(shí)存在與轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者的生存期改善有關(guān)，并可預(yù)測(cè)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的臨床效果。與這些觀察一致的是，B細(xì)胞與免疫治療反應(yīng)有關(guān)。Hollern等在高突變負(fù)荷的三陰性乳腺癌小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，免疫檢查點(diǎn)抑制劑可誘導(dǎo)濾泡輔助性T細(xì)胞和B細(xì)胞的活化，而活化的B細(xì)胞通過分泌抗體和呈遞抗原激活T細(xì)胞來促進(jìn)抗腫瘤反應(yīng)。與小鼠研究的這些發(fā)現(xiàn)相一致，臨床研究也強(qiáng)調(diào)B細(xì)胞與三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)在腫瘤免疫治療中的重要性。例如，Jahrsd?rfer等發(fā)現(xiàn)B細(xì)胞可產(chǎn)生顆粒酶B，并可在B-CLL中基于IL-2活化而獲得細(xì)胞毒性。此外，Petitprez等發(fā)現(xiàn)，包含B細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞的三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)為特征的軟組織肉瘤亞型患者，其生存率改善，PD-1阻斷劑反應(yīng)率較高。同時(shí)，Helmink等發(fā)現(xiàn)，在對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療有反應(yīng)的轉(zhuǎn)移性黑色素瘤和轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌（RCC）患者腫瘤的三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)中，CD20 B細(xì)胞與T細(xì)胞存在共定位。此外，他們進(jìn)一步鑒定到有反應(yīng)患者中存在明顯的克隆擴(kuò)增和BCR多樣性，為深入了解B細(xì)胞和三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)在腫瘤免疫治療的關(guān)鍵作用提供視角。

因此，盡管還需要進(jìn)一步研究以闡明B細(xì)胞介導(dǎo)反應(yīng)在免疫治療中的機(jī)制，這些發(fā)現(xiàn)已指出B細(xì)胞在抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)中的關(guān)鍵作用，并表明B細(xì)胞和三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)在腫瘤治療的重要應(yīng)用。

NK細(xì)胞 （自然殺傷細(xì)胞）

NK細(xì)胞是能發(fā)揮細(xì)胞毒作用而無MHC特異性的典型固有淋巴樣細(xì)胞，因此能與細(xì)胞毒性T細(xì)胞所介導(dǎo)的MHC限制性腫瘤溶解相輔相成。NK細(xì)胞可通過溶細(xì)胞顆粒直接清除腫瘤細(xì)胞，還可通過促炎細(xì)胞因子和趨化因子協(xié)同其他免疫細(xì)胞起作用。重要的是，NK細(xì)胞的活化是由其表面的激活或抑制性受體共同介導(dǎo)的。抑制性受體能與正常細(xì)胞上的MHC I類分子相互作用，使NK細(xì)胞產(chǎn)生自身耐受。而激活性受體則感知細(xì)胞應(yīng)激（病毒感染或病毒感染細(xì)胞發(fā)生腫瘤增生，及或腫瘤細(xì)胞MHC I類分子表達(dá)缺失）的信號(hào)，從而引起NK細(xì)胞的活化和效應(yīng)作用。越來越多研究表明，在腫瘤微環(huán)境中，NK細(xì)胞的功能會(huì)因細(xì)胞毒效應(yīng)減弱和促炎性因子的表達(dá)改變而受到阻礙。B?ttcher等發(fā)現(xiàn)腫瘤中的NK細(xì)胞能在腫瘤微環(huán)境中募集cDC1 細(xì)胞，并促進(jìn)抗腫瘤免疫，而腫瘤細(xì)胞能產(chǎn)生前列腺素E2損害NK細(xì)胞的功能，引起免疫逃逸。因此，NK細(xì)胞也可作為潛在的靶點(diǎn)。

現(xiàn)已探索出幾個(gè)基于NK細(xì)胞的免疫治療, 包括過繼轉(zhuǎn)移自體抑制NK細(xì)胞，也就是把從活體中提取的活化NK 細(xì)胞和，經(jīng)體外擴(kuò)增后輸注到患者體內(nèi)。還有CAR-NK細(xì)胞治療，也就是輸注改造過的NK細(xì)胞，這類NK細(xì)胞能表達(dá)抗特定腫瘤抗原CARs。還有細(xì)胞因子治療，也就是輸注增強(qiáng)NK細(xì)胞活性的特定細(xì)胞因子。最后，還有基于mAbs的治療，指輸注抗體以阻斷NK細(xì)胞上的抑制性受體。

跟阻斷T細(xì)胞上抑制性通路的免疫檢查點(diǎn)抑制劑相似，阻斷NK細(xì)胞上的抑制性受體同樣頗有前景。幾種NK細(xì)胞抑制性受體的治療潛力和臨床應(yīng)用已經(jīng)在探索階段。殺傷免疫球蛋白受體家族（KIR）和CD94/NKG2A異質(zhì)二聚體是人類NK細(xì)胞上主要的抑制性受體。單獨(dú)應(yīng)用抗KIR抗體或聯(lián)合其他治療藥物能提高NK細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)。另外，抗NKG2A抗體在觸發(fā)NK細(xì)胞反應(yīng)方面同樣有效。還有Monalizumab，一種新型抗NKG2A抗體，目前正處在檢驗(yàn)抗腫瘤效能的臨床試驗(yàn)階段。需要著重說明的是，除了抑制受體，激活受體也能被利用, 如用細(xì)胞因子上調(diào)它們的表達(dá)，或傳遞覆蓋目標(biāo)細(xì)胞的抗體來激發(fā)NK細(xì)胞毒性。舉個(gè)應(yīng)用該方法頗有成效的例子，Andrade 等設(shè)計(jì)了可避免人腫瘤細(xì)胞丟失細(xì)胞表面MICA和MICB的抗體，MICA和MICB都是應(yīng)激誘導(dǎo)分子，能被NK細(xì)胞上NKG2D的激活受體識(shí)別。他們還發(fā)現(xiàn)，這些抗體通過增強(qiáng)NK細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫抑制腫瘤生長(zhǎng)。綜合考慮，將NK細(xì)胞應(yīng)用于治療中有很好的前景，值得進(jìn)一步探索。

骨髓細(xì)胞

髓系細(xì)胞包含異質(zhì)的細(xì)胞亞群，有粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞，它們也被證明在腫瘤免疫中扮演關(guān)鍵的作用。

粒細(xì)胞中最常見的亞型是中性粒細(xì)胞，其典型功能是在固有免疫中抵抗細(xì)菌和真菌感染，但其在腫瘤免疫中的角色尚具爭(zhēng)議。Szczerba等發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞輔助血流中循環(huán)腫瘤細(xì)胞，有促進(jìn)其轉(zhuǎn)移的潛能。而Ponzetta等則發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞在一種固有樣表型非常規(guī)T細(xì)胞的極化中起關(guān)鍵作用，因此有助于抗腫瘤免疫。另外，F(xiàn)ridlender等發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中有不同的激活狀態(tài)，N1表型起抗腫瘤生成作用，而N2起促腫瘤生成作用。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞作用的多樣性，因此有必要做更深入的研究，全面剖析人類腫瘤中的腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞，而這有可能開啟通過調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞作為腫瘤治療的新模式。

單核吞噬細(xì)胞，由單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞組成，通過感知病原體和吞噬作用在固有免疫中起作用，并作為相互作用的細(xì)胞成分在適應(yīng)性免疫中將抗原提呈給T細(xì)胞。樹突狀細(xì)胞是主要的抗原呈遞細(xì)胞，現(xiàn)已確認(rèn)樹突狀細(xì)胞主要有兩種亞型，即類漿細(xì)胞樹突狀細(xì)胞（pDCs）和傳統(tǒng)樹突狀細(xì)胞（cDCs）。pDCs能產(chǎn)生高水平 I型干擾素并在調(diào)節(jié)固有和適應(yīng)性免疫中起重要作用。雖然pDCs最初被認(rèn)為在抗病毒免疫中起作用，但近期研究者對(duì)其在腫瘤發(fā)生方面起的作用產(chǎn)生了興趣。研究表明，pDCs的次級(jí)產(chǎn)物，尤其是I型干擾素，在腫瘤免疫中同時(shí)有免疫原性和致耐受性作用。這些因子通過提高NK細(xì)胞和T細(xì)胞的細(xì)胞毒性，輔助激活B細(xì)胞向漿細(xì)胞分化，促進(jìn)樹突狀細(xì)胞和促炎癥反應(yīng)性巨噬細(xì)胞的成熟和活化，最終共同促成一個(gè)免疫活化的腫瘤微環(huán)境。它們同時(shí)通過募集Treg細(xì)胞或誘導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)分子（如參與負(fù)調(diào)控途徑的免疫調(diào)節(jié)分子）的表達(dá)，營(yíng)造免疫抑制腫瘤微環(huán)境。另外，pDCs能作為專業(yè)的抗原呈遞細(xì)胞調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫反應(yīng)。因此，pDCs在腫瘤免疫中的多樣化角色尚未明晰。cDCs包含兩種亞型：cDC1s和cDC2s，它們有著不同的表型，功能和轉(zhuǎn)錄因子依賴。cDC1s專門將MHC I上的抗原提呈給CD8 T細(xì)胞。而cDC2s將MHC II上的抗原提呈給CD4 T細(xì)胞。cDC1s通過腫瘤微環(huán)境里的局部效應(yīng)和向腫瘤引流淋巴結(jié)(dLNs)的抗原呈遞促成抗腫瘤免疫。具體來說，腫瘤微環(huán)境中的cDC1s分泌如CXCL9和CXCL10的趨化因子以協(xié)助效應(yīng)T細(xì)胞和NK細(xì)胞向腫瘤聚集，還產(chǎn)生細(xì)胞因子幫助維持效應(yīng)細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。另外，cDC1s能遷移到引流淋巴結(jié)，將腫瘤抗原多肽提呈給初始型CD8 T細(xì)胞，引起抗原特異性免疫反應(yīng)的活化和啟動(dòng)。cDC2s是最常見且異質(zhì)性最高的DC亞型，它們促進(jìn)大量CD4 T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。雖然cDC2s被認(rèn)為主要通過激活T細(xì)胞來起作用，但其在抗腫瘤免疫中的具體作用尚未明確。研究者對(duì)解析cDC2s在腫瘤微環(huán)境中的異質(zhì)性和功能的興趣與日俱增。

巨噬細(xì)胞是一類吞噬細(xì)胞，包括一群在腫瘤微環(huán)境中有復(fù)雜表型和特性作用的異質(zhì)性細(xì)胞群。巨噬細(xì)胞能通過吞噬作用或通過產(chǎn)生可溶性因子誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡從而清除惡性細(xì)胞。除了直接的腫瘤殺傷能力，巨噬細(xì)胞還通過血管新生，纖維化和免疫監(jiān)測(cè)等機(jī)制，在調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展中起重要作用，巨噬細(xì)胞可通過分泌不同分子動(dòng)員或中和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子來發(fā)揮促血管生成和抗血管生成作用，從而調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中的血管生成。同時(shí)，巨噬細(xì)胞是腫瘤相關(guān)纖維化的關(guān)鍵協(xié)調(diào)者，它通過不同的介質(zhì)來促進(jìn)或抑制細(xì)胞外基質(zhì)堆積，從而改變鄰近的成纖維細(xì)胞，誘導(dǎo)形成的纖維化能調(diào)節(jié)T細(xì)胞的滲透和活化。此外，巨噬細(xì)胞能產(chǎn)生干擾素IL-12和表達(dá)包括CD86在內(nèi)的共刺激分子，引起細(xì)胞相互作用，從而介導(dǎo)T細(xì)胞活化。相反，巨噬細(xì)胞也能通過表達(dá)T細(xì)胞抑制分子，分泌免疫抑制性因子或促進(jìn)免疫抑制性Tregs募集這三種方式介導(dǎo)T細(xì)胞的抑制。因此，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）在腫瘤微環(huán)境中有顯著的作用，并可能帶來腫瘤免疫治療的新機(jī)遇。

單細(xì)胞水平研究腫瘤免疫浸潤(rùn)細(xì)胞的新技術(shù)

作為適應(yīng)性免疫的關(guān)鍵組成部分，T細(xì)胞由于其對(duì)抗原識(shí)別的特異性和強(qiáng)大的腫瘤殺傷力而成為免疫治療的核心。腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞是由具有復(fù)雜功能狀態(tài)（如幼稚，效應(yīng)因子，記憶和功能障礙）的不同亞群組成的異質(zhì)細(xì)胞群（如CD8 +，CD4 + TH1，TH2，TH17和Treg細(xì)胞）。另外，這些T細(xì)胞亞群表現(xiàn)出對(duì)組織分布的偏好和表腫瘤微環(huán)境中的跨組織遷移和狀態(tài)轉(zhuǎn)變的動(dòng)態(tài)特性。

由于這種異質(zhì)性，常規(guī)方法無法解析各種T細(xì)胞亞群的特征。隨著單細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，單細(xì)胞分析下大量腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的特點(diǎn)引起腫瘤免疫學(xué)家的極大興趣。最近，新型單細(xì)胞方法，包括質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)和單細(xì)胞測(cè)序（scRNA-seq），已呈現(xiàn)出發(fā)展勢(shì)頭，并促進(jìn)對(duì)腫瘤相關(guān)T細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞特點(diǎn)的了解（圖2和 圖3）。

單細(xì)胞蛋白質(zhì)分析是了解腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞表型異質(zhì)性的重要方法。質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)（CyTOF）利用金屬同位素標(biāo)記的抗體與微調(diào)質(zhì)譜檢測(cè)相結(jié)合，能夠以低成本量化數(shù)百萬個(gè)細(xì)胞中的40多種蛋白質(zhì)。相比之下，單細(xì)胞測(cè)序包括plate-based 和droplet-based兩種技術(shù)方法(圖2a)，可以同時(shí)量化成千上萬個(gè)轉(zhuǎn)錄本。因此，它能夠揭示稀有細(xì)胞群，揭示復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，并跟蹤發(fā)育過程。近來，這兩種方法已用于評(píng)估各種類型腫瘤的腫瘤生態(tài)系統(tǒng)(圖2), 因?yàn)榈鞍捉M和轉(zhuǎn)錄組都可以提供對(duì)腫瘤微環(huán)境中免疫浸潤(rùn)功能特征的重要認(rèn)識(shí)。

通過單細(xì)胞技術(shù)捕獲T細(xì)胞狀態(tài)

單細(xì)胞研究描繪不同類型腫瘤組織如皮膚，肺，腎，乳腺，結(jié)腸和頭顱的T細(xì)胞特征，包括組成、功能狀態(tài)以及病灶的動(dòng)態(tài)變化 (圖2b)。這些研究使我們對(duì)腫瘤免疫浸潤(rùn)有了一定了解，為探究免疫逃逸的機(jī)制和開發(fā)進(jìn)一步增強(qiáng)抗腫瘤免疫力的新策略提供機(jī)遇。

高腫瘤突變負(fù)荷（TMB）黑色素瘤，由于其對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療具有高反應(yīng)率，因此處于腫瘤免疫學(xué)研究的前沿。Tirosh等應(yīng)用scRNA-seq方法研究轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的多細(xì)胞生態(tài)系統(tǒng)，并分析惡性細(xì)胞和非惡性細(xì)胞的表型多樣性。盡管受細(xì)胞數(shù)量的限制，但該研究通過T細(xì)胞分析再現(xiàn)腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的衰竭表型。同樣，Li等發(fā)現(xiàn)功能失調(diào)的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞是高度增殖，動(dòng)態(tài)分化的單克隆細(xì)胞群，在黑素瘤的腫瘤微環(huán)境中表現(xiàn)出連續(xù)的分化圖譜。這樣的研究為我們提供了解TME腫瘤微環(huán)境中T細(xì)胞特征的機(jī)會(huì)，并擴(kuò)展我們對(duì)人類黑素瘤T細(xì)胞功能衰竭的認(rèn)識(shí)。

肺癌具有廣泛的基因組改變，并且對(duì)檢查點(diǎn)阻斷治療有更好的應(yīng)答。因此，肺癌通常是腫瘤免疫治療的研究目標(biāo)。Lambrechts等提出肺癌中腫瘤生態(tài)系統(tǒng)的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)目錄。然而，盡管有大量免疫細(xì)胞，但他們強(qiáng)調(diào)基質(zhì)細(xì)胞的表型構(gòu)建及其對(duì)免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)，從而與免疫治療建立間接聯(lián)系。相反，Lavin等利用質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)繪制與早期肺癌相關(guān)的免疫細(xì)胞圖譜。 他們通過在腫瘤病灶處觀察到CD8效應(yīng)T細(xì)胞顯著減少，伴隨著Tregs細(xì)胞擴(kuò)增和T細(xì)胞耗竭，發(fā)現(xiàn)免疫抑制性微環(huán)境。類似地，GUO等應(yīng)用scRNA-seq技術(shù)描繪非小細(xì)胞肺癌中T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)情況。他們描繪腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的變化軌跡，并確定兩簇將耗竭CD8 T細(xì)胞的功能狀態(tài)，這兩種細(xì)胞均與良好預(yù)后相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)為肺癌T細(xì)胞的功能狀態(tài)和動(dòng)力學(xué)提供更深入的見解，這將有助于腫瘤治療和患者分層。

腎細(xì)胞癌（RCC）是成人中最常見的腎臟腫瘤，盡管與黑色素瘤或非小細(xì)胞肺癌相比其腫瘤突變負(fù)荷較低，但是其插入和缺失突變率卻很高。腎細(xì)胞癌患者的亞型可受益于免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療，而納武單抗（nivolumab）是一種已被批準(zhǔn)用于治療轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌的抗PD-1抗體。Young等構(gòu)建健康人和腫瘤患者腎臟的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并鑒定腎腫瘤細(xì)胞及其組成。盡管他們同時(shí)鑒定免疫細(xì)胞和非免疫細(xì)胞，并重點(diǎn)關(guān)注非免疫細(xì)胞部分，但其提供的腎細(xì)胞癌中免疫細(xì)胞功能的信息仍然有限。相比之下，Chevrier等提出基于質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)的透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌（ccRCC）（最常見的腎細(xì)胞癌類型）中免疫浸潤(rùn)的單細(xì)胞圖譜，并揭示腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的表型復(fù)雜性。透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌中T細(xì)胞的免疫抑制表型，包括功能耗竭T細(xì)胞和抑制性Tregs細(xì)胞。這些發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展了我們對(duì)T細(xì)胞表型多樣性的看法，并為腎細(xì)胞癌的免疫治療提供候選靶點(diǎn)。

結(jié)直腸癌（CRC）對(duì)免疫腫瘤學(xué)家的吸引力很大，因?yàn)槠淠[瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞比組織病理學(xué)方法更能預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌患者的存活率。此外，免疫檢查點(diǎn)抑制劑對(duì)患有微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（MSI）的結(jié)直腸癌患者有效，但對(duì)微衛(wèi)星穩(wěn)定的患者無效，其分子機(jī)制尚不明確。Li等學(xué)者使用scRNA-seq技術(shù)進(jìn)行結(jié)直腸癌腫瘤生態(tài)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄組分析。由于該研究專注于聚類算法開發(fā)，因此該研究提供的生物學(xué)見解有限，尤其是對(duì)于結(jié)直腸癌中的免疫細(xì)胞功能。值得注意的是Zhang等通過RNA測(cè)序和TCR追蹤（STARTRAC）法整合單T細(xì)胞分析，對(duì)結(jié)直腸癌中的T細(xì)胞進(jìn)行綜合分析。

他們闡述具有不同功能和不同克隆的T細(xì)胞亞群動(dòng)態(tài)關(guān)系。此外，他們發(fā)現(xiàn)Th1樣亞型主要表達(dá)微衛(wèi)星不穩(wěn)定性患者中，這闡釋其對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑反應(yīng)良好的潛在細(xì)胞機(jī)制。這些發(fā)現(xiàn)加深我們對(duì)CRC中T細(xì)胞特征的了解，并加速了免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療機(jī)制的研究。

由于免疫學(xué)上的“冷結(jié)節(jié)”表型，乳腺癌（BC）歷來被認(rèn)為難以進(jìn)行免疫治療，但最近研究表明，免疫檢查點(diǎn)抑制劑具有改善乳腺癌患者亞型結(jié)局的潛力。單細(xì)胞研究提供對(duì)腫瘤生態(tài)系統(tǒng)的了解，包括乳腺癌中的免疫細(xì)胞多樣性。Chung等在原發(fā)性乳腺癌中進(jìn)行單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析。盡管受細(xì)胞數(shù)量的限制，但這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌腫瘤微環(huán)境中腫瘤內(nèi)存在異質(zhì)性并觀察到T細(xì)胞顯示出的免疫抑制特性。同樣，Savas等揭示乳腺癌中T細(xì)胞亞群的細(xì)胞異質(zhì)性，并發(fā)現(xiàn)有助于乳腺癌免疫監(jiān)視的組織駐留記憶T細(xì)胞亞群表達(dá)高水平免疫檢查點(diǎn)分子和效應(yīng)蛋白。盡管此類分析為乳腺癌腫瘤學(xué)中的T細(xì)胞功能提供重要線索，但是在乳腺癌中腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的表型可塑性和動(dòng)態(tài)變化仍需進(jìn)一步探索。重要的是，Azizi等提供人類乳腺癌中免疫細(xì)胞的大規(guī)模單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄圖。他們發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞簇具有多種不同的環(huán)境特征，腫瘤駐留T細(xì)胞被定位在連續(xù)的活化和分化軌跡上，組合的環(huán)境刺激和TCR利用塑造腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的多種表型。這項(xiàng)研究為乳腺癌中腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的表型多樣性提供更為細(xì)致入微的觀點(diǎn)，這可能有助于更好地了解腫瘤進(jìn)展和治療反應(yīng)的機(jī)制。盡管涉及不同的乳腺癌亞型，但該研究受患者人數(shù)的限制，無法提供足夠的信息來評(píng)估乳腺癌各類亞型中免疫細(xì)胞表型的區(qū)別。相反，Wagner等破譯具有乳腺癌亞型的患者的腫瘤和免疫細(xì)胞的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)，從而了解不同乳腺癌亞型之間的生態(tài)系統(tǒng)差異，尤其是免疫細(xì)胞的差異。值得注意的是，他們?cè)诟呒?jí)別雌激素受體陰性（ER-）和ER陽性（ER+）腫瘤中觀察到較高水平的Tregs細(xì)胞和耗竭T細(xì)胞，可能表明ER-和ER+患者有對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑更好反應(yīng)的細(xì)胞基礎(chǔ)。在乳腺癌生態(tài)系統(tǒng)中的此類腫瘤免疫關(guān)系，可以幫助指導(dǎo)患者分層并促進(jìn)個(gè)性化免疫治療。其他具有腫瘤微環(huán)境單細(xì)胞特點(diǎn)的腫瘤包括頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSCC）和肝細(xì)胞癌（HCC）。Puram等通過scRNA-seq技術(shù)研究了頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中的原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤生態(tài)系統(tǒng)。他們鑒定頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中不同的T細(xì)胞亞群，并確定T細(xì)胞功能衰竭程序，然而，由于關(guān)注點(diǎn)主要集中于非免疫部分，他們提供的關(guān)于T細(xì)胞功能的信息則是有限的。Zheng等繪制肝癌單細(xì)胞T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄圖譜，并通過觀察腫瘤中浸潤(rùn)的Tregs細(xì)胞和CD8 T細(xì)胞的克隆富集，發(fā)現(xiàn)腫瘤內(nèi)T細(xì)胞的免疫抑制表型。這項(xiàng)研究首次對(duì)腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞進(jìn)行大規(guī)模和深入分析，揭示HCC進(jìn)展的潛在細(xì)胞機(jī)制。

綜合來說，這些基線數(shù)據(jù)分析共同闡明多種腫瘤中腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的基本特性。不同腫瘤中的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞在抗腫瘤免疫方面表現(xiàn)出共同和特定的特點(diǎn)，這可能是由不同器官的特殊組織微環(huán)境驅(qū)動(dòng)的。因此，對(duì)更多腫瘤患者進(jìn)行T細(xì)胞特征的全面分析將闡明腫瘤進(jìn)展的機(jī)制和治療應(yīng)答的差異，從而促進(jìn)腫瘤治療中的個(gè)性化免疫治療。

盡管細(xì)胞組成和功能狀態(tài)是腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的主要特點(diǎn)，但其抗原特異性也可作為抗腫瘤免疫應(yīng)答的關(guān)鍵決定因素，并可影響免疫治療的有效性。越來越多證據(jù)表明，腫瘤中相當(dāng)一部分T細(xì)胞與癌旁正常組織有共同的TCR（T細(xì)胞受體），這表明它們可能與抗腫瘤免疫無關(guān)。此類T細(xì)胞代表靶向突變背景或病毒感染的“旁觀者”T細(xì)胞，或者它們可能反映由腫瘤內(nèi)炎癥反應(yīng)驅(qū)動(dòng)的效應(yīng)或記憶T細(xì)胞從血液向組織的連續(xù)遷移。重要的是，臨床上有效的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞是靶向腫瘤抗原T細(xì)胞；因此，分離腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞對(duì)基于T細(xì)胞的免疫治療至關(guān)重要。實(shí)際上，目前已經(jīng)建立用于確定、分離和擴(kuò)增T細(xì)胞特異性抗原的創(chuàng)新策略。Simoni等證明特異性標(biāo)記物如CD39可用于鑒定腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞。 Tran等將腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞與自體樹突狀細(xì)胞共培養(yǎng)，并體外轉(zhuǎn)染編碼自體腫瘤突變基因短肽的串聯(lián)基因mRNA，以分離與腫瘤特異性抗原反應(yīng)的T細(xì)胞。此外，Dijkstra等利用自體腫瘤類器官與PBLs（外周血B淋巴細(xì)胞)的共培養(yǎng)來從外周血中富集腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞。這種方法為臨床應(yīng)用提供分離腫瘤反應(yīng)性T細(xì)胞的有效手段。

雖然上述未經(jīng)治療腫瘤的基線概況分析提供了腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞在多種腫瘤中的固有特性，但關(guān)于治療或干預(yù)研究可更好地了解免疫治療分子基礎(chǔ)和開發(fā)預(yù)測(cè)臨床療效的新方法。Jerby-Arnon等應(yīng)用scRNA-seq技術(shù)研究免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療前后人黑素瘤中的腫瘤細(xì)胞狀態(tài)。他們發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤細(xì)胞可以表達(dá)與T細(xì)胞排斥和免疫逃逸相關(guān)的耐藥性程序，結(jié)合免疫治療可抑制腫瘤的生長(zhǎng)。這些發(fā)現(xiàn)提出攻克免疫檢查點(diǎn)抑制劑耐藥的新策略。然而，與腫瘤細(xì)胞的分子變化相比，人們更多關(guān)注免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療中腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的表型和功能動(dòng)力學(xué)。通過對(duì)接受免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療的黑色素瘤患者單個(gè)免疫細(xì)胞進(jìn)行分析，Sade-Feldman等發(fā)現(xiàn)CD8 T細(xì)胞表達(dá)TCF7蛋白或功能失調(diào)的兩種獨(dú)特狀態(tài)可以預(yù)測(cè)免疫檢查點(diǎn)治療的成功或失敗，從而突顯腫瘤微環(huán)境中異種T細(xì)胞亞型的臨床意義。同樣，Yost等對(duì)抗PD-1抑制劑治療的基底或鱗狀細(xì)胞癌患者T細(xì)胞進(jìn)行成對(duì)單細(xì)胞RNA和TCR測(cè)序，并揭示PD-1阻斷后腫瘤特異性T細(xì)胞的克隆替代。具體來說，他們發(fā)現(xiàn)免疫檢查點(diǎn)抑制劑處理可誘導(dǎo)T細(xì)胞的克隆擴(kuò)增，而克隆擴(kuò)增并非源自先前存在的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞，而是由新型克隆型組成。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)全身免疫反應(yīng)的重要性以及募集外周T細(xì)胞對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療有效的必要性。

外周血中T細(xì)胞可以遷移并浸潤(rùn)到腫瘤中，以補(bǔ)充效應(yīng)池。因此，在免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療前和后人外周血單個(gè)核細(xì)胞的變化也得到深入研究。Wu等對(duì)不同腫瘤患者T細(xì)胞RNA和TCR進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，他們發(fā)現(xiàn)在腫瘤組織、鄰近正常組織和外周血整個(gè)系統(tǒng)水平上，類效應(yīng)器T細(xì)胞的克隆性擴(kuò)增可以介導(dǎo)更好地抗PD-L1治療反應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)表明，對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑有效應(yīng)答需要外周血中補(bǔ)充新鮮的、未耗竭的T細(xì)胞。同樣，Krieg等使用質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)鑒定轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者抗PD-1免疫治療之前和之后外周血中的免疫細(xì)胞亞群。他們發(fā)現(xiàn)，在應(yīng)答者中，當(dāng)腫瘤中CD8 T細(xì)胞增加時(shí)外周血中的T細(xì)胞則是減少的，這表明免疫檢查點(diǎn)抑制劑應(yīng)答和系統(tǒng)免疫具有重要性的主要原因是CD8 T細(xì)胞具有更高的遷移能力。值得注意的是，他們發(fā)現(xiàn)髓樣細(xì)胞的突變頻率還可以預(yù)測(cè)抗PD-1治療反應(yīng)性，從而強(qiáng)調(diào)髓樣細(xì)胞在抗腫瘤免疫應(yīng)答及其潛在臨床應(yīng)用中的重要性。

盡管T細(xì)胞已是腫瘤免疫治療的重要靶點(diǎn)，人們希望采用單細(xì)胞技術(shù)探索髓樣細(xì)胞的異質(zhì)性。近年來，髓樣細(xì)胞也受到關(guān)注，因?yàn)樗铇蛹?xì)胞在腫瘤微環(huán)境中表現(xiàn)出特定的表型和功能，這些表型、功能通過調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能、直接調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，進(jìn)而影響腫瘤進(jìn)展和免疫治療的反應(yīng) （圖3）。

作為專職抗原呈遞細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞不僅在T細(xì)胞活化中起著核心作用，并且是維持長(zhǎng)期抗腫瘤適應(yīng)性免疫反應(yīng)的必要條件。從不同樹突狀細(xì)胞亞群的表型和功能來看，雖然pDCs和cDC1在抗腫瘤免疫中的作用可能還需要進(jìn)一步驗(yàn)證，但是由于二者構(gòu)成相對(duì)同質(zhì)，目前它們的功能較為清楚。相比之下，cDC2s由異質(zhì)組分構(gòu)成，因此其功能尚不清楚。單細(xì)胞技術(shù)使人們不論在健康和疾病狀態(tài)下都可以全面探知樹突狀細(xì)胞組分。例如，Villani等使用scRNA-seq在人血液的cDC2s亞群中確定一個(gè)新的分支表型。同樣，Ductertre等在風(fēng)濕性疾病活動(dòng)性相關(guān)的循環(huán)炎性樹突狀細(xì)胞和生物標(biāo)記物的基礎(chǔ)上, 從功能上揭示cDC2s中獨(dú)特的亞群。關(guān)于腫瘤中樹突狀細(xì)胞亞群，Brown等發(fā)現(xiàn)以不同發(fā)育途徑和轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子為特征的兩種主要cDC2s譜系，二者在小鼠和人類黑色素瘤中表現(xiàn)出明顯的促炎和抗炎潛能。Zhang等報(bào)道稱，表達(dá)LAMP3的cDCs子細(xì)胞亞群可從肝腫瘤轉(zhuǎn)移到肝淋巴結(jié)并調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的活化。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)樹突狀細(xì)胞亞群的異質(zhì)性，并促進(jìn)樹突狀細(xì)胞特定亞群相關(guān)靶向免疫治療的發(fā)展。

圖2.不同類型腫瘤單細(xì)胞分析策略和單細(xì)胞研究。a.單細(xì)胞技術(shù)工作流程，包括單細(xì)胞測(cè)序和流式細(xì)胞術(shù)。對(duì)于單細(xì)胞測(cè)序，深度分析或大規(guī)模分析基于平板和液滴的常用策略。b.基于目前單細(xì)胞技術(shù)分離各種組織類型腫瘤免疫浸潤(rùn)的研究總結(jié)。（注：Tech技術(shù)；FACS熒光激活細(xì)胞分選；T腫瘤；N鄰近正常或健康組織；P外周血；其他細(xì)胞、非免疫細(xì)胞（包括惡性細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞）；scTCR單細(xì)胞TCR信息；BCC基底細(xì)胞癌；SCC鱗狀細(xì)胞癌；NSCLC非小細(xì)胞肺癌；RCC腎癌；ccRCC腎透明細(xì)胞癌；CRC大腸癌；BC乳腺癌；HCC肝細(xì)胞；HNSCC頭頸部鱗狀細(xì)胞癌；Endo AD子宮內(nèi)膜腺癌。）