《食品科學(xué)》：浙江大學(xué)呂瑞玲助理研究員等：超聲聯(lián)合紫外處理對(duì)大腸桿菌O157:H7的殺菌作用及機(jī)制

微生物污染是最主要的食品安全問(wèn)題，其中大腸桿菌（

Escherichia coli

）是主要的致病微生物之一。

超聲技術(shù)作為一種非熱殺菌手段，能夠在不破壞食品原有風(fēng)味、營(yíng)養(yǎng)成分和色澤的同時(shí)實(shí)現(xiàn)有效的微生物滅活。然而超聲單獨(dú)處理存在殺菌效率不足的局限性，且空化效應(yīng)可能導(dǎo)致氣溶膠擴(kuò)散引發(fā)潛在的交叉污染風(fēng)險(xiǎn)。目前，已有研究將超聲與其他非熱技術(shù)（如紫外、電解水、脈沖電場(chǎng)等）結(jié)合使用，從而實(shí)現(xiàn)能源利用效率和成本效益的最優(yōu)化。紫外是電磁波譜中波長(zhǎng)介于10 nm至400 nm之間的一部分，根據(jù)波長(zhǎng)不同，可分為紫外-A（315～400 nm）、紫外-B（280～315 nm）和紫外-C（100～280 nm）。其中，紫外-C波段對(duì)微生物具有最強(qiáng)的殺菌效果，其作用機(jī)制主要是通過(guò)破壞微生物DNA中的嘧啶和胞嘧啶基對(duì)，干擾遺傳物質(zhì)的正常復(fù)制與轉(zhuǎn)錄過(guò)程，從而達(dá)到殺菌目的。

浙江大學(xué)寧波國(guó)際科創(chuàng)中心的吳雨豪、陳怡、呂瑞玲*等當(dāng)前研究主要集中于通過(guò)調(diào)控超聲參數(shù)（頻率和功率）、紫外參數(shù)（波長(zhǎng)和輻照時(shí)間）以及操作條件（溫度、壓力和介質(zhì)性質(zhì)）優(yōu)化超聲與紫外的聯(lián)合使用。盡管該聯(lián)合技術(shù)的殺菌效果已被廣泛證實(shí)，但其具體的殺菌機(jī)制及協(xié)同作用仍缺乏系統(tǒng)性闡釋。本研究基于動(dòng)力學(xué)模型擬合大腸桿菌O157:H7的殺菌曲線(xiàn)，并從多維度分析超聲、紫外及其聯(lián)合應(yīng)用對(duì)大腸桿菌O157:H7的綜合影響，包括細(xì)菌形態(tài)變化、細(xì)胞膜性質(zhì)改變及氧化應(yīng)激水平等方面，通過(guò)細(xì)胞層面的初步探討揭示超聲與紫外聯(lián)合處理的殺菌機(jī)制，以期為其在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

01

超聲和紫外處理對(duì)大腸桿菌O157:H7的殺菌作用

如圖2a所示，不同處理方式對(duì)大腸桿菌O157:H7的殺菌效果存在顯著差異。短時(shí)間作用下，超聲處理組的細(xì)菌計(jì)數(shù)（lg（CFU/mL））隨時(shí)間幾乎沒(méi)有變化，單獨(dú)超聲殺菌效果并不顯著。相比之下，紫外處理組菌落計(jì)數(shù)隨處理時(shí)間持續(xù)下降，處理40 s殺滅約2（lg（CFU/mL））的菌株。聯(lián)合處理組殺菌效果最為顯著，處理10 s即導(dǎo)致菌落數(shù)迅速下降，40 s聯(lián)合處理殺滅了8.3（lg（CFU/mL））的大腸桿菌O157:H7。因此，超聲聯(lián)合紫外處理可能存在協(xié)同效應(yīng)，從而顯著提升殺菌效率。腸桿菌O157:H7的活菌數(shù)都在減少。但先超聲后紫外在40 s內(nèi)減少了約4（lg（CFU/mL））的活菌，顯著高于先紫外后超聲組的1.5（lg（CFU/mL）），這表明超聲可能通過(guò)破壞菌體結(jié)構(gòu)，顯著增強(qiáng)了后續(xù)紫外處理的殺菌效率。

圖2b比較了超聲紫外不同處理順序?qū)Υ竽c桿菌O157:H7殺菌效果的影響?？梢钥闯鲭S著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，兩種處理方式下大腸桿菌O157:H7的活菌數(shù)都在減少。但先超聲后紫外在40 s內(nèi)減少了約4（lg（CFU/mL））的活菌，顯著高于先紫外后超聲組的1.5（lg（CFU/mL）），這表明超聲可能通過(guò)破壞菌體結(jié)構(gòu)，顯著增強(qiáng)了后續(xù)紫外處理的殺菌效率。

表1顯示隨處理時(shí)間延長(zhǎng)，聯(lián)合處理表現(xiàn)出顯著的協(xié)同效應(yīng)，且該效應(yīng)的增長(zhǎng)速度整體上呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)，40 s時(shí)達(dá)到（5.21±0.19）（lg（CFU/mL））。超聲的機(jī)械效應(yīng)促使溶液振動(dòng)，可加強(qiáng)紫外對(duì)細(xì)菌表面的均勻殺菌能力。有研究指出，超聲生成的空化泡在細(xì)菌附近區(qū)域破裂時(shí)，其崩潰產(chǎn)生的劇烈壓力變化能對(duì)細(xì)胞造成機(jī)械傷害，如Lv Ruiling等研究發(fā)現(xiàn)超聲處理后蠟樣芽孢桿菌芽孢外壁脫落引起芽孢體積減小，表面光滑。此外，超聲還可能觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)機(jī)械敏感離子通道的活化，進(jìn)一步促進(jìn)紫外滲透，實(shí)現(xiàn)更高效的協(xié)同殺菌。

02

超聲和紫外協(xié)同殺菌機(jī)制的動(dòng)力學(xué)模型

采用Log-liner模型、Weibull模型以及Log-Logistic模型分析不同處理過(guò)程中大腸桿菌O157:H7的殺菌動(dòng)態(tài)。利用R2、以及RMSE等參數(shù)評(píng)估模型擬合優(yōu)度。圖3顯示大腸桿菌O157:H7的殺菌曲線(xiàn)并未展現(xiàn)出線(xiàn)性特征。非線(xiàn)性擬合的Weibull模型對(duì)單獨(dú)超聲和單獨(dú)紫外處理組表現(xiàn)出最佳擬合效果（

b

接近1）（表2），表明殺菌速率保持恒定，這可能是由于處理時(shí)間相對(duì)較短。通常情況下，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，剩余的細(xì)胞可能會(huì)表現(xiàn)出更高的抗性。據(jù)已有研究顯示，這種抗性的增強(qiáng)可能歸因于被破壞的細(xì)胞或死細(xì)胞發(fā)生聚集現(xiàn)象。聯(lián)合處理組的Weibull模型

b

值大于1，說(shuō)明殺菌速率隨時(shí)間遞增。相比之下，非線(xiàn)性模型中的Log-Logistic模型難以準(zhǔn)確描述超聲聯(lián)合紫外處理的動(dòng)態(tài)過(guò)程（R2最?。?，其預(yù)設(shè)的“S”形曲線(xiàn)與實(shí)際殺菌過(guò)程中微生物死亡速率逐漸增快的模式不符。比較分析證實(shí)Weibull模型最適合表征超聲和紫外協(xié)同殺菌過(guò)程（值最大，RMSE值最?。?。與張雅琪等關(guān)于超聲輔助的蒸汽殺菌的非線(xiàn)性動(dòng)力學(xué)模型結(jié)果一致，表明Weibull模型在描繪協(xié)同殺菌動(dòng)態(tài)過(guò)程上具有更強(qiáng)的適用性。

03

超聲和紫外處理對(duì)細(xì)胞膜完整性的影響

PI是一種熒光染料，僅能通過(guò)受損的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部與DNA結(jié)合，當(dāng)這些結(jié)合后的PI受到光的激發(fā)時(shí)，會(huì)發(fā)出紅色熒光，因此可作為細(xì)胞膜完整性的有效指示劑。圖4展示了大腸桿菌O157:H7經(jīng)超聲、紫外及聯(lián)合處理后經(jīng)PI染色的結(jié)果。在40 s短時(shí)間處理下，單獨(dú)超聲和聯(lián)合處理組的熒光強(qiáng)度與對(duì)照組無(wú)顯著差異，而單獨(dú)紫外處理組熒光強(qiáng)度有所降低。這表明細(xì)胞膜作為超聲作用的主要靶點(diǎn)，其受到的影響有限，作用機(jī)制可能主要通過(guò)在細(xì)胞膜上形成微孔，增加通透。但紫外照射可能損傷DNA，減少PI的結(jié)合位點(diǎn)，降低熒光。與平板計(jì)數(shù)法相比，聯(lián)合處理后的PI標(biāo)記率較低，這表明聯(lián)合處理可能不僅損傷細(xì)胞膜，還破壞了DNA結(jié)構(gòu)，從而影響PI的結(jié)合效率。

04

超聲和紫外處理對(duì)胞內(nèi)酯酶的影響

cFDA是一種親脂、本身不發(fā)光的化合物，它能自由通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。在細(xì)胞內(nèi)部，cFDA被非特異性的酯酶水解，生成一種具有熒光的極性探針cF，由于其極性的存在，cF無(wú)法穿越細(xì)胞膜返回至細(xì)胞外。因此，通過(guò)測(cè)定cF的熒光強(qiáng)度，能夠定量分析細(xì)胞內(nèi)的酯酶活性。圖5展示了大腸桿菌O157:H7在不同處理?xiàng)l件下經(jīng)cFDA染色后的熒光強(qiáng)度。超聲處理組與對(duì)照組無(wú)顯著差異，表明單獨(dú)使用超聲處理對(duì)細(xì)胞內(nèi)酯酶活性影響有限，可能歸因于革蘭氏陰性菌特有外膜結(jié)構(gòu)中脂多糖形成的分子屏障，有效抵御多種外源性分子的侵襲如表面活性劑、溶菌酶、疏水性染料及抗生素等，限制了cFDA的滲透能力，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率受到影響。而紫外處理組熒光強(qiáng)度顯著低于對(duì)照組，說(shuō)明紫外處理可能降低了細(xì)胞的酯酶活性，對(duì)細(xì)胞造成了損傷。超聲與紫外聯(lián)合處理組的熒光強(qiáng)度明顯高于其他處理組，可能的機(jī)制是當(dāng)?shù)蛷?qiáng)度超聲場(chǎng)在短時(shí)間內(nèi)作用于大腸桿菌O157:H7時(shí)，能夠有效破壞其細(xì)胞外膜結(jié)構(gòu)，進(jìn)而使得cFDA染料能夠順利進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)被轉(zhuǎn)化成cF。超聲和紫外的協(xié)同效應(yīng)中，超聲可能促進(jìn)紫外對(duì)細(xì)胞的影響，或者是兩種處理方法導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，從而增加了細(xì)胞對(duì)cFDA的轉(zhuǎn)化效率。

05

超聲和紫外處理對(duì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響

透射電子顯微鏡（圖6）揭示了大腸桿菌O157:H7經(jīng)不同處理后的超微結(jié)構(gòu)變化。未經(jīng)處理的細(xì)菌細(xì)胞（圖6A）呈現(xiàn)正常的短桿狀，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，結(jié)構(gòu)完整，無(wú)明顯損傷，細(xì)胞壁清晰，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)分布均勻。超聲處理組（圖6B）相較對(duì)照組顯示出一定程度的形態(tài)改變，部分細(xì)胞的邊緣出現(xiàn)不規(guī)則性改變，這表明短時(shí)間內(nèi)超聲處理對(duì)細(xì)胞壁和膜造成了一定的機(jī)械損傷。紫外處理組（圖6C）表現(xiàn)出更顯著的結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞壁模糊，細(xì)胞內(nèi)部出現(xiàn)不規(guī)則的空洞，可能是紫外導(dǎo)致DNA損傷后細(xì)胞內(nèi)容物流失的結(jié)果。圖6D中，超聲與紫外聯(lián)合處理后大腸桿菌O157:H7顯示出更為嚴(yán)重的損傷，細(xì)胞壁和膜結(jié)構(gòu)破損明顯，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)嚴(yán)重受損，空洞更為顯著，表明超聲和紫外的協(xié)同效應(yīng)對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞作用最強(qiáng)。綜合圖像可以得出，超聲和紫外處理對(duì)大腸桿菌O157:H7造成了從輕微到重度不等的損傷，且聯(lián)合處理具有更強(qiáng)的破壞作用，從而影響細(xì)胞功能和存活。

06

超聲和紫外處理對(duì)胞內(nèi)ATP含量的影響

ATP不僅是細(xì)胞內(nèi)的主要能量載體，支撐著細(xì)胞各種生命活動(dòng)，也是應(yīng)對(duì)外界刺激的信號(hào)分子，在細(xì)胞受到壓力時(shí)會(huì)從細(xì)胞內(nèi)部釋放到外部。圖7顯示，與對(duì)照組相比，超聲處理細(xì)胞內(nèi)ATP含量有所上升，表明超聲處理可能對(duì)細(xì)胞代謝活動(dòng)造成了影響。而紫外處理后，大腸桿菌O157:H7胞內(nèi)ATP含量相比對(duì)照組無(wú)顯著變化，這可能是因?yàn)樽贤廨椛鋵?duì)細(xì)胞的能量代謝有更強(qiáng)的抑制作用。經(jīng)超聲與紫外聯(lián)合處理后，細(xì)菌胞內(nèi)ATP含量有所上升，這與通常預(yù)期聯(lián)合處理會(huì)有更強(qiáng)的抑制效果相反。這種現(xiàn)象可能表明短時(shí)間內(nèi)聯(lián)合處理后細(xì)胞通過(guò)某種機(jī)制維持或恢復(fù)了ATP生成，或者這些處理可能誘導(dǎo)了細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致ATP含量暫時(shí)性增高，也可能源于超聲產(chǎn)生的較弱的微流效應(yīng)對(duì)ATP合成過(guò)程起到了某種促進(jìn)作用。綜合上述結(jié)果可以推斷，無(wú)論是超聲還是紫外處理，均會(huì)對(duì)大腸桿菌O157:H7的能量代謝產(chǎn)生影響。然而，當(dāng)這兩種處理方式聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，可能引發(fā)了更為復(fù)雜的生物學(xué)響應(yīng)，進(jìn)一步擾亂了細(xì)菌的正常生理功能。這種聯(lián)合效應(yīng)最終導(dǎo)致細(xì)胞活力的顯著降低，甚至引發(fā)細(xì)胞死亡。

07

超聲和紫外處理對(duì)胞內(nèi)活性氧水平的影響

如圖8所示，各處理組活性氧水平較對(duì)照組顯著升高，聯(lián)合處理組熒光強(qiáng)度達(dá)到最高，為4.96±0.16。超聲處理組熒光強(qiáng)度略高于對(duì)照組，表明超聲處理可能誘導(dǎo)了輕微的氧化應(yīng)激，導(dǎo)致活性氧水平升高。紫外處理組熒光強(qiáng)度進(jìn)一步提升，暗示紫外照射較超聲更能促進(jìn)活性氧的產(chǎn)生，這可能與其引發(fā)的DNA和細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷有關(guān)。而超聲與紫外聯(lián)合處理組展現(xiàn)出最高的熒光強(qiáng)度，顯著高于其他所有處理組，這可能表明超聲和紫外的組合作用極大地增加了活性氧的產(chǎn)生，這種增加的氧化應(yīng)激可能對(duì)細(xì)胞功能產(chǎn)生重大影響。

08

超聲和紫外處理對(duì)DNA的損傷

圖9展示了大腸桿菌O157:H7在不同處理?xiàng)l件下經(jīng)Hoechst染料染色后的熒光強(qiáng)度。超聲處理組熒光強(qiáng)度高于對(duì)照組，表明超聲處理導(dǎo)致細(xì)胞膜的滲透性增加，使Hoechst染料更易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA結(jié)合。低強(qiáng)度超聲主要作用于DNA超螺旋結(jié)構(gòu)，使其結(jié)構(gòu)變得松散，暴露出更多的雙螺旋小溝區(qū)域，為Hoechst染料提供了更多的結(jié)合位點(diǎn)。相反，紫外處理組熒光強(qiáng)度較低，這可能意味著紫外照射損傷了DNA，或減少了細(xì)胞內(nèi)可結(jié)合染料的位點(diǎn)。超聲與紫外聯(lián)合處理時(shí)大腸桿菌O157:H7熒光強(qiáng)度最高，達(dá)到51.90±3.10，這可能是由于超聲和紫外的聯(lián)合效應(yīng)增強(qiáng)了染料與DNA的結(jié)合，或者因?yàn)樘幚韺?dǎo)致了DNA裸露或累積損傷，增加了染料結(jié)合位點(diǎn)，表明該處理可能對(duì)細(xì)胞DNA造成了顯著的結(jié)構(gòu)改變或損傷。研究表明，超聲穩(wěn)態(tài)空化產(chǎn)生的微聲流以及瞬時(shí)空化所引發(fā)的剪切力共同作用于大腸桿菌O157:H7的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)，從而顯著改變了其DNA結(jié)構(gòu)。但在超聲與紫外聯(lián)合作用后，對(duì)DNA具體的損傷機(jī)制尚不明確。因此，下一步應(yīng)深入分析聯(lián)合處理下大腸桿菌O157:H7的差異表達(dá)基因，從分子層面對(duì)殺菌機(jī)制作出探究。

結(jié)論

超聲和紫外聯(lián)合處理殺菌具有協(xié)同效應(yīng)，40 s即可殺死8.3（lg（CFU/mL））的大腸桿菌O157:H7。本研究初步探討了超聲聯(lián)合紫外處理殺滅大腸桿菌O157:H7的機(jī)制，聯(lián)合處理對(duì)細(xì)胞DNA造成了顯著的結(jié)構(gòu)改變或損傷，影響PI的結(jié)合效率。同時(shí)超聲可能促進(jìn)了紫外對(duì)細(xì)胞的影響，導(dǎo)致細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，從而增加了細(xì)胞對(duì)cFDA的轉(zhuǎn)化效率。通過(guò)比較不同處理方式對(duì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響，可以發(fā)現(xiàn)聯(lián)合處理對(duì)細(xì)胞功能和存活具有最大的破壞作用。短時(shí)間內(nèi)聯(lián)合處理誘導(dǎo)了細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致ATP含量暫時(shí)性增高繼而影響細(xì)菌的正常生理功能。同時(shí)，超聲的機(jī)械效應(yīng)促使自由基等氧化性物質(zhì)滲透細(xì)胞膜，在與紫外聯(lián)合處理下，進(jìn)一步增加了細(xì)胞的氧化應(yīng)激，引起細(xì)胞內(nèi)活性氧水平上升。

作者簡(jiǎn)介

通信作者：

呂瑞玲 助理研究員

浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院

主要研究方向?yàn)槭称沸滦图庸ぜ夹g(shù)、食品微生物檢測(cè)與控制，博士畢業(yè)于浙江大學(xué)，期間曾赴加拿大不列顛哥倫比亞大學(xué)（UBC）訪(fǎng)學(xué)1年。現(xiàn)任

Applied Sciences

客座編委，

Food Research International、Applied Microbiology and Biotechnology

等國(guó)際期刊審稿人，國(guó)際食品工程學(xué)會(huì)（SOFE）會(huì)員，國(guó)際食品保護(hù)協(xié)會(huì)（IAFP）會(huì)員。在國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)會(huì)議作學(xué)術(shù)報(bào)告5次，墻報(bào)展示5次，獲最佳口頭報(bào)告獎(jiǎng)1。近5年在

LWT-Food Science and Technology, Ultrasonics sonochemistry, Food Control

等知名期刊發(fā)表SCI論文40余篇，其中第一/通信作者19 篇；主持國(guó)家自然科學(xué)基金、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)子課題、寧波市自然科學(xué)基金等項(xiàng)目課題7 項(xiàng)；參與編寫(xiě)英文專(zhuān)著2 本，教材1 本；申請(qǐng)國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利8項(xiàng)，授權(quán)4 項(xiàng)。

第一作者：

陳怡 碩士研究生

浙江大學(xué)食品工程

畢業(yè)于華中科技大學(xué)分析化學(xué)專(zhuān)業(yè)，碩士研究生學(xué)歷，現(xiàn)為湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院檢驗(yàn)技術(shù)人員，主要研究方向?yàn)槭称钒踩焖贆z測(cè)。主持國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管總局科技計(jì)劃等項(xiàng)目，曾獲得“湖北五一勞動(dòng)獎(jiǎng)?wù)隆?、“湖北省技術(shù)能手”等榮譽(yù)。

本文《超聲聯(lián)合紫外處理對(duì)大腸桿菌O157:H7的殺菌作用及機(jī)制》來(lái)源于《食品科學(xué)》2025年46卷第19期10-17頁(yè)，作者：陳怡，吳雨豪，周建偉，劉東紅，呂瑞玲。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250224-119。點(diǎn)擊下方閱讀原文即可查看文章相關(guān)信息。

實(shí)習(xí)編輯：李杭生；責(zé)任編輯：張睿梅。點(diǎn)擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來(lái)源于文章原文及攝圖網(wǎng)