Sci Adv.I 甲型流感病毒劫持LC3-中心粒周圍蛋白-動力蛋白銜接復合物實現宿主細胞質入侵

2025年6月11日由奧胡斯大學Fulvio Reggiori團隊在《Science Advance》雜志上發表題為“Influenza A virus subverts the LC3-pericentrin dynein adaptor complex for host cytoplasm entry”的研究論文。

研究背景

甲型流感病毒（IAV）是一種重要的人類呼吸道病原體。其基因組包裹在病毒核糖核蛋白（vRNP）復合體中，該復合體進入細胞后，需通過“脫殼”將遺傳物質釋放到細胞質中，進而感染宿主。以往研究表明，IAV 可利用細胞內“聚集小體加工機制”（APM），通過組蛋白去乙酰化酶6（HDAC6）識別 vRNP 上的非錨定泛素鏈，進而驅動微管和肌球蛋白運動，促進病毒脫殼。此外，轉運蛋白TNPO1等因子也參與部分脫殼過程，但這些途徑被抑制后，病毒感染僅部分受損，暗示存在其他機制。本研究揭示了另一條關鍵通路：自噬相關蛋白 LC3 與 pericentrin（PCNT）形成銜接復合體，直接介導 vRNP 與驅動蛋白dynein 1 的結合，從而在病毒進入細胞的內體位置啟動脫殼。該機制與HDAC6依賴的APM通路并行，形成功能冗余，表明IAV已進化出兩種冗余策略來劫持動力蛋白分子馬達，以高效完成細胞質入侵。

研究結果

結果1：

HDAC6并非介導IAV細胞質入侵的唯一動力銜接蛋白

為揭示IAV利用細胞動力蛋白入侵細胞質的具體途徑，作者首先利用siRNA技術分別抑制了宿主細胞內的HDAC6（已知的病毒脫殼相關蛋白）和DYNC1I1（動力蛋白1的核心組分）。實驗結果表明，抑制HDAC6僅能使IAV的感染效率下降約50%，而抑制DYNC1I1則幾乎完全阻斷了病毒的復制。為進一步探究細胞骨架的作用進一步采用了藥物干預。發現單純解聚微管只能部分抑制IAV復制，而直接抑制動力蛋白功能或阻斷內體酸化則能實現近90%的強烈抑制。尤為關鍵的是，當同時破壞微管和肌動蛋白時，其對病毒復制的抑制效果與直接靶向動力蛋白相當，這說明IAV所利用的動力蛋白系統需要這兩種細胞骨架網絡的協同配合。此外，研究還證實這種依賴具有病毒特異性，并非所有病毒都同樣需要此通路。在細胞質入侵的實驗中，作者發現，當DYNC1I1被抑制后，病毒蛋白M1幾乎完全被禁錮在內體結構中無法釋放；而HDAC6被抑制時，僅出現部分滯留。這為DYNC1I1是病毒實現細胞質入侵的關鍵樞紐提供了最直觀的證據，并最終確證：HDAC6并非IAV用以連接并利用動力蛋白系統的唯一適配器。

果2：LC3蛋白而非完整自噬機制對IAV感染至關重要

為探究IAV如何利用動力蛋白，作者首先利用基因敲除細胞系發現，缺失全部三種LC3蛋白（LC3A/B/C）會顯著抑制IAV感染，而缺失另一亞家族GABARAPs則無影響，這表明LC3s在IAV感染中具有獨特且關鍵的作用。進一步實驗表明，三種LC3異構體在功能上存在冗余，任一成員均能恢復LC3缺失細胞中的病毒感染能力。為研究其是否依賴于經典自噬途徑，作者在缺失自噬關鍵蛋白（如ATG7、ATG13或ATG16L1）的細胞發現自噬核心蛋白的缺失并不影響病毒復制，證明LC3s促進IAV感染的功能獨立于完整的自噬機制。更重要的是，研究人員構建了多種LC3B突變體，發現即使是被改造為無法進行脂化的LC3B變體，也同樣能有效支持IAV感染。這最終證實，LC3s是通過其非脂化的“I型”形式，以一種不依賴于自噬的全新機制，在IAV感染周期中發揮關鍵作用。

結果3：LC3促進IAV從LAMP1陽性晚期內體脫殼

本研究進一步探究了LC3s在IAV感染周期中的具體作用環節。通過細胞質入侵實驗發現，在缺失所有LC3s的細胞中，病毒的M1蛋白幾乎全部以點狀結構被困于細胞內，其狀況與使用藥物抑制內體酸化的效果類似。共定位分析發現，M1主要與晚期內體標志物LAMP1結合，與早期內體標志物SNX1幾乎無共定位，且共定位程度高于正常細胞，表明LC3缺失導致IAV被困于晚期內體。此外，作者還排除了LC3s影響其他早期步驟的可能性，發現病毒與細胞表面的結合以及其內吞過程在LC3s缺失的細胞中均未受影響。同時，其他依賴低pH內體環境入侵的病毒（如HSV-1和VaV）在LC3s缺失細胞中的感染依然正常，這表明LC3s的缺失并未造成普遍的內體功能缺陷，其對IAV感染的抑制是特異性的。

結果4：LC3在IAV細胞質入侵過程中與vRNP及動力蛋白1相互作用

為闡明LC3s分子層面的作用機制，作者通過免疫熒光發現，在IAV感染過程中，部分LC3斑點與病毒M1蛋白共定位，而使用Baf抑制內體酸化則會顯著減少此共定位，證明LC3s被特異性招募至病毒vRNPs釋放的位點。同時，LC3還能與動力蛋白1亞基DYNC1I1結合，且結合具有特異性-參與自噬體轉運的驅動蛋白KIF5B未在共沉淀產物中檢出，LC3也不與HDAC6結合，這些結果表明，在IAV細胞質入侵過程中，LC3可作為橋梁，同時結合vRNP與動力蛋白1，且該相互作用獨立于HDAC6介導的聚集體處理機制，形成一條新的動力蛋白銜接途徑，為vRNP借助動力蛋白實現細胞質入侵提供直接分子連接。

結果5：動力蛋白銜接蛋白PCNT是IAV細胞質入侵的必需因子

本研究旨在揭示連接LC3s與動力蛋白1（Dynein 1）的關鍵適配器蛋白。通過在感染IAV的細胞中進行LC3免疫共沉淀及質譜分析，研究人員鑒定出15個已知能與動力蛋白相互作用的候選蛋白。隨后，通過siRNA逐一敲低這些候選基因并進行功能篩選，發現其中PCNT（ pericentrin ）的缺失能顯著抑制IAV復制。進一步的細胞質進入實驗證實，敲低PCNT會特異性地阻礙病毒顆粒在內體中的脫殼過程，導致病毒M1蛋白更多地滯留于晚期內體/溶酶體中，但其滯留程度弱于直接敲低動力蛋白亞基DYNC1I1，提示PCNT在此過程中起部分作用。此外，PCNT的缺失并不影響病毒對細胞的附著與內吞，也不影響其他病毒（如HSV-1和VaV）的感染，表明其功能具有IAV特異性。

結果6：IAV感染不依賴于PCNT在中心體組裝中的作用

為探究PCNT蛋白在IAV感染中的具體作用機制，首先，研究人員使用藥物抑制中心體組裝，發現這確實會顯著抑制IAV感染，提示中心體結構可能與病毒感染有關。然而，PCNT存在兩種剪接異構體（PCNTS和PCNTB），實驗證明兩者均能有效恢復PCNT缺失細胞中的IAV感染能力，表明它們在功能上具有冗余性。為了直接檢驗PCNT的病毒相關功能是否依賴于其定位至中心體的能力，研究人員構建了缺失PACT結構域的PCNT突變體。令人意外的是，即使無法定位到中心體，這種突變體依然能夠有效支持IAV感染。此外，研究還證實，敲低PCNT、LC3s或動力蛋白亞基DYNC1I1，并不會影響微管網絡或中心粒的正常組織結構，排除了因細胞結構破壞間接影響病毒感染的潛在可能。這些結果表明PCNT在促進IAV感染過程中的功能是獨立于其在中心體組裝中的經典作用的。

結果7：LC3與PCNT形成介導IAV細胞質入侵的動力蛋白銜接復合物

本研究最終闡明了LC3s與PCNT在IAV脫殼過程中的協同作用機制。基因敲低實驗顯示，同時沉默PCNT和LC3s對病毒感染的抑制效果并未疊加，表明二者作用于同一通路。反之，同時沉默PCNT和HDAC6則能強烈抑制感染，效果與直接敲低動力蛋白亞基DYNC1I1相當，這確證了PCNT/LC3和HDAC6是兩條獨立且功能冗余的動力蛋白依賴通路。這種機制在不同IAV亞型中存在差異：H1N1和H5N1同時利用這兩條通路，而H3N2主要依賴LC3-PCNT模塊，提示病毒亞型演化出了不同的細胞質入侵策。為了確定 PCNT 是否是促進 IAV 與 LC3 一起脫衣的動力蛋白 1 接頭，我們在耗盡 PCNT 的 atg7?/? 細胞中使用 LC3 抗體進行了IP，發現病毒vRNP與LC3s結合，而PCNT作為關鍵銜接橋，一端與LC3s（進而間接連接vRNP）關聯，另一端直接結合動力蛋白亞基DYNC1I1。值得注意的是，PCNT的缺失并不影響LC3s被招募至病毒所在的內體，但會導致LC3s與病毒蛋白在內體上的滯留增加。這些數據揭示了LC3s和PCNT形成了一個獨立的動力蛋白適配器復合物，該復合物與HDAC6通路并行，共同介導病毒顆粒在內體上的脫殼及其后續的細胞質侵入。

本研究首次揭示了一條全新的、獨立的脫殼機制：自噬蛋白LC3s與中心體蛋白PCNT在內體上形成一個銜接復合體，該復合體能直接“挾持”細胞內的動力蛋白（Dynein 1），從而將病毒基因組成功“拽”入細胞質。尤為重要的是，LC3s和PCNT在此過程中的功能完全獨立于它們已知的自噬和中心體組裝功能。當同時抑制這條新通路和已知的APM通路時，對病毒感染的抑制作用最強，證明IAV進化出了兩條功能冗余的“雙保險”策略來劫持宿主細胞的動力系統，以確保其成功入侵。這項研究極大地深化了我們對流感病毒生命周期的理解，并為開發針對病毒入侵環節的新型廣譜抗病毒策略提供了全新的潛在靶點。

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/40498831/

DOI:10.1126/sciadv.adu7602

來源：ZhaoSunLab

編輯：吃一口小貓