Nat Immunol |?多發性硬化癥中克隆擴增CD8+?T細胞的抗原特異性

撰文 |章臺柳

多發性硬化癥（ MS ）是一種中樞神經系統（ CNS ）的炎癥性脫髓鞘疾病，其中 T 細胞深度參與其病理過程。 CD4+ 和 CD8+ T 細胞均被發現存在于 MS 病灶的血管周圍間隙以及腦實質中。相對于 CD4+ T 細胞， CD8+ T 細胞在 MS 病灶中富集并發生克隆性擴增，這表明存在局部抗原驅動的擴增。特定的主要組織相容性復合體（ MHC ） I 類等位基因也會改變 MS 的易感性，這進一步支持了細胞毒性 CD8?T 細胞在 MS 生物學中的關鍵作用。獲取中樞神經系統組織以分析MS中的浸潤性T細胞反應是侵入性的，并且很少在疾病早期進行。腦脊液（CSF）是淋巴細胞進入中樞神經系統的中轉站，為了解中樞神經系統內部的免疫反應提供了一個窗口。對腦脊液免疫細胞庫的研究確實表明，其與MS病灶中擴增的T細胞群體存在高度的克隆重疊。這就為識別在中樞神經系統中獨特擴增的 T 細胞，尤其是 CD8+ T 細胞，并確定其表型特征和抗原特異性，提供了可行性。

近日 ，來自 加利福尼亞大學舊金山分校的 Joseph J. Sabatino Jr 和 Scott S. Zamvil 團隊合作 在 Nature Immunology 雜 志上發表文章 Antigen specificity of clonally enriched CD8+ T cells in multiple sclerosis ，通過對MS隊列和對照組個體的腦脊液及血液進行全面的單細胞RNA測序和T細胞受體測序分析，發現了一組23個高度擴增且高度活化的CD8+ T細胞克隆型，這些克隆型主要在MS隊列的腦脊液中富集。通過無偏倚和靶向抗原發現方法，鑒定出六種識別EB病毒（EBV）抗原及多種新型模擬表位的CD8+ T細胞克隆型。盡管大多數模擬表位未能引發功能性免疫應答，但從MS患者中發現的三種擴增CD8+ T細胞受體對EBV具有反應性。在腦脊液中檢測到EBV DNA和轉錄本，包括在那些具有高度擴增的EBV特異性CD8+ T細胞的MS患者中。這些發現為理解CD8+ T細胞在MS中的作用提供了重要啟示，并支持EBV在MS免疫病理學中的重要作用。

研究共招募了18名個體——11名復發緩解型MS患者，2名臨床孤立綜合征（CIS）患者，2名其他神經炎癥性疾病（OND）患者和3名健康對照（HCs）。MS和CIS（MS/CIS）隊列中的所有患者在樣本采集時均未接受過治療（即，既往無免疫調節或免疫抑制劑治療史），但一名OND患者 正在接受TNF-α抑制劑免疫治療 。每位參與者在同一天采集配對外周血和腦脊液樣本。對新鮮獲取的、包含所有未分離細胞亞群的樣本，使用10X Genomics 5'建庫試劑盒進行配對的scRNA-seq和scTCR-seq，以實現單細胞轉錄組表型和TCR克隆分析的結合。scRNA - seq分析顯示，與 HC/OND 隊列相比， MS/CIS 患者中的 CD8+ 和 CD4+ T 細胞都處于更活化的狀態，效應功能和歸巢能力增強。相對應的， MS/CIS 患者的血液和腦脊液中存在更多樣化的 CD4+ 和 CD8+ T 細胞克隆型。分析克隆擴增的情況，發現在腦脊液中觀察到小部分克隆擴增的 CD4+ T 細胞，但在 MS/CIS 組和 HC/OND 組中總體上高度和中度擴增的 CD8+ T 細胞的比例類似。雖然只有1 .5% 的克隆型在兩個部位同時存在，但進一步提取出在腦脊液中富集擴增的T細胞克隆型（其腦脊液頻率至少是同一個體外周血頻率兩倍的克隆型），鑒定出33個高度腦脊液富集且擴增的T細胞克隆型，它們在腦脊液中的頻率約為外周血頻率的2倍到超過100倍不等。結合scRNA - seq分析基因表達，發現腦脊液中高度克隆擴增的T細胞表達的基因特征提示其具有豐富的抗原經歷、細胞毒性以及獨特的組織歸巢能力。

隨后，研究人員探究高度擴增的腦脊液富集 CD8+ T 細胞所識別的抗原。首先利用肽：MHC（pMHC）酵母展示文庫，該文庫在給定的 MHC 等位基因上展示約 1-10×10? 個隨機肽段，用于探測單個 TCR 的識別情況。盡管這種無偏倚的抗原發現方法產生了幾個CD 8+ T細胞克隆型的新穎模擬表位，這些表位可通過pMHC I四聚體結合檢測到，但均未對天然存在的抗原表現出功能性反應性。其次，研究人員在幾個公共TCR數據庫中查詢高度擴增的腦脊液富集TCR克隆型。發現來自參與者 MS8 的一個 CD8 + T 細胞克隆型（ 86333_1456 ）與一個被充分描述的 EB 病毒（ EBV ）表位 EBNA3A 193-201 （ FLRGRAYGL ）的 TCRα 和β序列完全匹配，并且pMHC I四聚體分析驗證其特異性，且能夠被相關EBV肽段刺激并產生明顯的細胞因子，即證明了具有功能。進一步分析顯示，在 MS 患者的腦脊液中，至少有三種高度擴增的 CD8+ T 細胞對 EBV 具有特異性，但大多數富集 T 細胞克隆型的特異性仍然未知，且 EBV 特異性 CD8+ T 細胞擴增在 MS 患者的腦脊液中（相比血液）特異增加。將這三種腦脊液擴增的 CD8+ T 細胞克隆型的轉錄特征與所有其他腦脊液擴增和富集的 CD8+ T 細胞進行比較，發現腦脊液中 EBV 擴增的 CD8+ T 細胞是與濾泡歸巢和 B 細胞相互作用相關的效應細胞群。在測試的自身抗原肽段中，未呈現出自身抗原交叉反應性。說明這些克隆擴增的CD 8+ T細胞在腦脊液中的富集可能是由對EBV的反應性驅動的。

那么，EBV是否存在于腦脊液中？從所有參與者的腦脊液中提取DNA，并用EBV BZLF1基因特異性引物進行PCR擴增，并對產物進行Sanger測序，發現在6/13的MS/CIS樣本和2/5的HC/OND樣本中檢測到EBV DNA。通過數字PCR（ddPCR）擴增EBER2基因來進一步量化EBV DNA的存在，發現幾乎所有的患者和對照研究參與者的腦脊液中都檢測到了EBV，盡管其相對豐度差異很大，其中MS/CIS患者的水平最高。對幾種潛伏期和裂解期基因的EBV轉錄本進行分析，發現在 MS/CIS 隊列（包括腦脊液中存在高度擴增的 EBV 特異性 CD8? T 細胞的患者 MS6 、 MS8 和 MS27 ）中觀察到 BamHI-W 轉錄本顯著增加，其他潛伏期和早期裂解基因在兩組間沒有差異。這表明 MS/CIS 患者腦脊液中 EBV 再激活增強，可能驅動了 EBV 特異性 CD8? T 細胞的擴增。

https://www.nature.com/articles/s41590-025-02412-3

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