V1超柱中持續活動的動態分組

Dynamic grouping of ongoing activity in V1 hypercolumns

V1超柱中持續活動的動態分組

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1053811925001594

摘要
神經元的自發活動為理解大腦提供了豐富信息。單個神經元的活動與其局部網絡密切相關。為了理解這種關系，我們利用雙光子鈣成像技術研究了獼猴V1和V2區數千個神經元的自發活動。在V1中，持續活動主要由全局波動主導，其中大多數神經元的活動彼此相關。神經元的活動還依賴于它們在局部功能結構（包括眼優勢圖、朝向圖和顏色圖）中的相對位置。具有相似偏好特性的神經元會動態地聚集成共激活的神經元集群，并呈現出與局部功能圖相似的空間模式。不同的集群具有不同的強度和頻率。這一現象在我們所檢測的所有V1超柱尺度區域中均一致存在。在V2中，不同成像位點具有不同的朝向和顏色特征；然而，在所采樣的區域內，自發活動同樣與底層的功能結構相關。這些結果表明，功能結構在影響神經元自發活動中起著關鍵作用。

關鍵詞：獼猴 V1、V2；自發活動；神經元集群；功能圖；雙光子鈣成像；功能連接

1. 引言

當我們觀察單個神經元時，其自發活動看起來是隨機的。然而，當同時觀察更多神經元時，我們發現神經元的自發活動常常彼此相關，尤其是空間上鄰近的神經元（Leopold 等，2003；Smith 和 Kohn，2008；Smith 和 Sommer，2013）。這種相關性的強度隨神經元的選擇性特征及其位置而變化（Maier 等，2010；Okun 等，2015）。這種變化可能源于皮層內在的功能網絡，例如朝向圖（Arieli 等，1995，1996；Tsodyks 等，1999；Singh 等，2008；Cai 等，2023）。然而，目前仍缺乏此類依賴關系的直接證據。

在非人靈長類動物中，其感覺皮層存在多種功能結構。例如，在V1區存在朝向圖、顏色圖和眼優勢圖。在Hubel和Wiesel提出的超柱模型中，一個面積約為1 mm2的皮層柱狀區域包含了上述所有特征的完整周期（Hubel 和 Wiesel，1974）。這些嵌套的網絡如何影響神經元的自發活動？單個神經元的活動是否由其在這些功能圖中的空間位置所決定？這些問題的答案目前尚不清楚。

雙光子鈣成像技術能夠在約1 mm2大小的皮層區域內同時記錄數百至數千個神經元的活動。該技術已被用于研究不同動物模型中的自發活動，例如小鼠（Goltstein 等，2015；Mizuno 等，2018）、大鼠（Ch’ng 和 Reid，2010）、貓（Ch’ng 和 Reid，2010）以及雪貂（Smith 等，2018）。據我們所知，目前尚無關于非人靈長類動物自發活動的雙光子研究報道。此前，我們曾利用雙光子鈣成像技術研究了神經元的視覺反應特性（Tang 等，2020）。在此，我們使用相同的技術考察了自發活動。我們根據神經元在其局部功能圖中的空間位置及其對視覺特征的選擇性，對其自發活動進行了表征。作為腦科學研究的經典模型，獼猴的自發活動已在微觀尺度（電生理）和宏觀尺度（fMRI）上被廣泛研究。雙光子成像具有獨特的分辨率與觀測尺度，能夠連接并整合這兩類研究結果。

1. 結果

我們在3只獼猴的V1和V2多個位點注射了AAV病毒以表達GCaMP6s蛋白，并植入了直徑為13 mm的慢性光學窗口（圖1A和B）。在隨后的麻醉實驗中，我們使用16倍物鏡采集鈣信號，成像視野大小為0.83 × 0.83 mm，幀率為1.3 Hz，成像深度為180–270 μm。每次實驗均首先進行自發活動成像，通常持續70分鐘（約5000幀），期間動物雙眼閉合。之后，對同一群神經元采集其視覺反應數據。視覺刺激為不同顏色和朝向的漂移光柵，以單眼或雙眼方式呈現，每種刺激持續2秒。每個成像位點可識別出約400–600個細胞（平均569個）（例如，圖1C）。神經元熒光活動的時間序列經過濾波（高通截止頻率0.005 Hz）、轉換為dF/F，并進行z-score標準化。以下所有結果均基于這些 n × m（細胞數 × 幀數）矩陣（例如，圖1F）。

在另一組獨立實驗中，我們還對這些光學窗口進行了內源信號光學成像，并獲得了基本的功能圖譜，用于與雙光子成像所獲得的功能圖譜進行比較（圖S1）。

2.1 自發活動的基本特征
在單個神經元中，自發鈣信號表現為看似隨機的波動（圖1D），其幅度小于視覺驅動反應的幅度（圖1E）。在群體水平上，神經元表現出爆發式的共激活現象（圖1F）。這些爆發通常涉及不同的神經元參與者，且某些自發活動幀的空間模式與刺激誘發的模式相似（即功能圖譜，圖1I&J）。這表明自發形成的神經元集群并非隨機產生，而是由某種內部機制所組織，該機制所產生的模式類似于外部刺激的作用效果。作為對照，若對每個神經元的自發活動進行相位重排（phase-shuffled），整體模式則完全不同（圖1H），且無法觀察到此類空間模式（例如圖1K）。

在單神經元層面，其自發激活率相近，范圍約為0.01~0.05 Hz（圖1L&M）。其平均波動幅度約為視覺刺激下波動幅度的67%（圖1N&O）。在群體層面，自發集群以平均0.15 Hz的頻率動態形成，每個集群持續約3秒（圖S2C）。無論是集群事件還是單細胞事件，其“爆發性”（burstiness）均低于隨機分布，表明自發事件在時間上分布更為均勻（圖S2 E&I）。集群規模（共激活神經元數量）與出現頻率（該規模集群被觀測到的頻率）呈負相關（圖S2C）。

2.2 群體活動中朝向模式
主成分分析（PCA）是一種有用的數據驅動分析工具，常用于fMRI數據分析（Carbonell 等，2011）。針對高維的自發活動數據，我們使用PCA降低其維度。如圖2A所示，PCA沿細胞軸（cell axis）進行了降維。降維后，前10個主成分（PCs）平均解釋了總方差的39.4 ± 5.6%（來自全部8個V1位點的平均值，圖2C），表明該方法有效。圖2B展示了某一示例位點的PC空間及自發活動數據，該數據包含約70分鐘內采集的5352幀，每一點代表一幀。數據點主要聚集為一個云團，未形成明顯分離的簇，表明在成像期間不存在多個主導性的離散狀態。

在沿細胞軸降維后，每個主成分可被視為一個“假設神經元”，其活動是原始神經元活動的加權和。因此，每個PC可被可視化為一幀權重圖（例如圖2D）。PC1表現為一種全局模式，其中所有神經元均具有較高權重。事實上，其時間進程幾乎與所有神經元z-score標準化活動之和完全一致（圖S3B）。它解釋了數據中26.4 ± 4.5%的方差，表明整個成像區域內神經元的共激活是自發活動中最主導的成分。其余PCs解釋的總方差小得多，但各自具有空間模式：其中一些與該區域的朝向圖相似（圖2E&F），另一些則與眼優勢圖或顏色圖相關性更高（圖2E）。這些相關性顯著高于相位重排后的對照數據（圖2G）。

作為對照，我們對每個神經元的自發活動進行了相位重排（與圖1H相同），并對重排后的數據執行相同的PCA。結果表明，所得主成分解釋總方差的能力極低（前10個PC僅解釋3.2 ± 0.5%的方差，圖S4B），且可視化后的PC既無系統性空間模式，也與功能圖譜無顯著相關性（圖S4 C&D）。這進一步支持我們觀察到的自發活動模式本質上是非隨機的。

由于PC軸中包含了朝向信息（圖2E&F），我們可通過將朝向反應數據投射到該PC空間來驗證這一點。我們將神經元對光柵刺激（新數據）的反應投射到由自發活動分析得到的PC空間（舊空間）中。如圖3B所示，8種不同朝向的光柵刺激（以不同顏色表示）所對應的幀在PC空間中聚集成8個分支，相鄰分支對應相鄰朝向。這證明該空間確實按照朝向信息進行了組織。

有了刺激幀在PC空間中的坐標后，我們進一步檢驗自發活動幀是否可被分類為不同的朝向類別。我們使用朝向刺激幀的PC坐標訓練了一個SVM分類器（圖3B），僅使用前10個PC軸的坐標，在9類分類任務（8個朝向 + 1個空白）中達到了85.8%的正確率（5折交叉驗證）。隨后，我們將該分類器應用于自發活動幀。結果顯示，23.2%的自發幀被分類為朝向幀，其余76.8%被歸類為空白（圖3C）。與刺激幀在PC空間中呈現的分離分支（圖3B）相比，自發幀的分布更為連續（圖3C），表明自發活動中朝向表征更加均勻。在SVM分類中貢獻最大的是PC2、PC3和PC4，因此用于可視化PCA結果（圖3A–C）。

最后，每一朝向類別下平均的自發活動幀與相應刺激條件下的平均幀高度相似（圖3D&E），其相關系數顯著高于使用人工合成刺激數據獲得的對照值（圖S5）。相關系數約為0.7，進一步證實了這些神經元中存在朝向特異性的共激活現象。盡管PC1代表全局活動，并不貢獻于特定朝向模式，但PC1權重較高的幀更有可能被分類為朝向模式（圖S3 D&E）。

2.3. 自發活動中眼優勢與顏色模式
在每次實驗中，我們還記錄了神經元對單眼黑白光柵以及雙眼彩色光柵刺激的反應。我們采用與前述相同的方法，將這些由刺激驅動的數據（幀）投影到利用自發活動數據所獲得的舊主成分（PC）空間中（即與圖2B相同）。圖3G顯示，在左眼刺激（紅色）和右眼刺激（藍色）期間采集的幀在PC空間中被清晰地分開。隨后，使用這些幀坐標訓練的支持向量機（SVM）分類器將6.8%的自發活動幀識別為單眼激活幀（圖3H）。這一結果也通過自發活動幀的平均模式與左眼或右眼功能圖之間的相似性得到了驗證（圖3I和J）。

我們還考察了顏色反應模式是否存在于自發活動中。采用相同方法，我們發現部分自發幀也可被歸類為與彩色光柵刺激所獲得的幀相似（圖S6C）。然而，平均后的彩色自發活動模式與彩色功能圖之間的相似性較弱（圖S6D和E），其相關系數范圍為0.15至0.59（總體Pearson相關系數 r = 0.41 ± 0.11）。我們由此得出結論：盡管顏色選擇性神經元的共激活確實存在于自發活動中，但其穩健性不如朝向和眼優勢相關的模式。這與我們之前利用內源性光學成像所得出的結果一致（Cai et al., 2023）。

到目前為止，自發活動模式僅以神經元形式呈現（圖3D和I，圖S6D）。我們還以幀的形式考察了相應的自發活動模式（圖S7），即對被分類出的幀的原始dF/F信號進行平均。盡管相關得分較低，但相應自發模式與功能圖之間的整體相似性仍然明顯（圖S7）。

在8個V1成像位點中，我們都觀察到了清晰的朝向和眼優勢模式存在于自發活動中。這些模式與對應功能圖的平均相關系數達到0.8，不同成像位點間的變異很小（圖3K）。作為對比，顏色模式的相關系數僅為0.41。這些模式的出現頻率在不同實驗之間有所差異（圖3L），這可能源于各次實驗中動物麻醉狀態的不同。一次實驗中朝向和眼優勢模式的出現頻率通常呈正相關（圖3L），這也支持上述假設。總之，這些觀察結果表明，具有共同偏好（如朝向、眼優勢）的神經元不僅在視覺刺激期間協同激活，在持續的自發活動中也是如此。

2.4. 具有相似調諧特性的神經元之間的相關活動
迄今為止，我們在神經元維度上進行了主成分分析（PCA）降維。同樣地，我們也對幀維度進行了PCA，以考察神經元是否能基于這種數據驅動方法聚類。如圖4A所示，每個PC軸代表一個幀，而幀空間中的每個數據點代表一個神經元。該幀空間的維度更高，因為前20個主成分僅解釋了25.3 ± 3.5%的方差（圖4B）。然而，我們觀察到不同朝向偏好神經元在此PC空間中存在分離（圖4C），左眼偏好與右眼偏好神經元之間也存在分離（圖4D）。這表明具有相同調諧偏好的神經元表現出相似的自發激活模式，且這些調諧特征（眼優勢、朝向）是影響神經元自發活動的主要因素之一（體現在前幾個主成分中）。

我們計算了偏好0°和90°神經元的平均向量，以及偏好45°和135°神經元的平均向量（圖4C中的箭頭）。對這些向量的可視化顯示出朝向模式（圖S8A和B）。這兩個向量在高維PC空間中彼此正交（圖S8D）。此外，這兩個向量也都與眼優勢神經元的向量（圖4D中的箭頭，另見圖S8D）正交。這些觀察結果表明，這些因素對神經元自發活動的影響是相互正交的，不同的功能網絡具有獨立的活動，彼此互不干擾。

這些結果也可以直接通過對神經元自發活動進行兩兩相關性計算得到。盡管大多數神經元呈正相關（由于全局信號），但相關程度存在差異。圖4E顯示，當神經元間距增大時，相關性下降；最高相關性出現在間距較短（約200 μm）的神經元對中（圖4E）。該數值與V1神經元基底樹突擴展的平均尺度以及V1神經元軸突終末斑塊的大小相當（Lund et al., 1993；Lund and Wu, 1997）。圖4F顯示，具有相似朝向偏好的神經元之間相關性更強。圖4G顯示，具有相似眼偏好的神經元之間相關性也更強；而眼偏好較弱（雙眼神經元）或眼偏好不同的神經元對則相關性較弱。

2.5. V2中的自發活動
我們還在V2區成像了3個位點。這3個位點位于V2條紋（stripes）的不同位置，其具體位置由內源信號光學成像獲得的功能圖所標示（圖S1）。與V1神經元不同，V2神經元大多為雙眼性，且無眼優勢或眼偏好較弱。此外，不同的條紋在朝向選擇性和顏色選擇性方面表現出顯著差異。

我們對V2數據進行了與前述相同的分析。圖5A展示了一個位于厚/淺條紋（thick/pale stripe）位點的數據。該位點具有較強的朝向選擇性，但顏色選擇性較弱。相應地，其自發活動中提取出的朝向模式很強（圖5E），而顏色模式則很弱（未顯示）。圖5F展示了另一個位于細條紋（thin stripe）的V2位點的數據。該位點的自發活動表現出強烈的顏色模式（圖5J），其相關系數（約0.5）高于在V1中觀察到的所有值（圖5K）。

因此，與V1類似，V2中的自發活動也呈現出與底層功能結構相關的模式。然而，這兩個區域之間也存在差異。例如，V2的顏色相關自發模式比V1更強。此外，由于成像區域較小，而V2的功能結構尺度較大，所成像的3個V2區域表現出非常不同的特征。相比之下，在V1中，8個成像區域具有相似的特性，表明這些成像區域的尺度接近V1的功能單元——超柱（hypercolumn）。

我們分析了麻醉獼猴V1和V2區群體神經元的自發活動。我們發現，神經元動態地形成了不同的活躍集群（active ensembles）。這些集群與已知的功能結構高度相似，包括不同的朝向偏好模式、眼優勢模式和顏色模式。因此，具有共同選擇性的神經元傾向于表現出更強的相關活動。在V1中，朝向和眼優勢對神經元自發活動均有顯著影響，而顏色的影響較弱。在V2中，根據具體記錄位點的不同，朝向和顏色可能對神經元自發活動產生強或弱的影響。這些結果為“自發活動依賴于底層功能結構”這一假說提供了直接證據。不同的功能結構對自發活動的貢獻程度不同。此外，這些神經元層面的證據支持了先前通過電壓敏感染料成像（Omer et al., 2019）和血流動力學成像（Cai et al., 2023）獲得的結果，并證實了他們所觀察到的介觀尺度功能連接具有神經起源。

3.1. 模式化自發活動的偏好性水平連接模型

這些類似功能結構的激活模式在很大程度上可由非均勻的水平連接（horizontal connections）來解釋。以往研究表明，在具有相似調諧特性的神經元之間存在偏好性的水平連接，包括朝向偏好（Gilbert and Wiesel, 1989；Kisvarday et al., 1997）、眼優勢（Malach et al., 1993；Yoshioka et al., 1996）以及顏色偏好（Livingstone and Hubel, 1984；Yoshioka et al., 1996；Yabuta and Callaway, 1998）。這些領域特異性（domain-specific）的連接與大量領域非特異性（domain-non-specific）的連接共存，后者連接的是距離較近的神經元，其范圍大致相當于神經突起（neurites）形態擴展的尺度（約200 μm；Lund et al., 1993；Lund and Wu, 1997；Malach et al., 1993；Yoshioka et al., 1996）。我們在短距離內觀察到的強兩兩相關性（圖4E）正與此類短程的領域非特異性連接一致。這些水平連接構成了相關性持續活動的形態學基礎。

如圖6中的概念模型所示，V1中的自發活動既受到外部輸入（例如來自外膝體LGN和V2的輸入）的影響，也受到區內連接（基于當前已有知識繪制）的調控。領域非特異性連接（圖6C中的灰色連線）是我們在實驗中觀察到的全局活動（圖2中的PC1）的形態學基礎；而不同類型功能域之間的領域特異性連接（圖6C中的藍色和紅色連線）則是多種自發活動模式（例如圖2中的PC2）的基礎。單個V1神經元通常位于多種類型網絡（如眼優勢、朝向、顏色）的交匯處，當它從上游區域和水平連接接收到足夠輸入時就會發放。其激活也會通過這些非均勻的連接對其周圍神經元產生非均勻的影響。正如我們所展示的那樣（圖S3D），這兩種類型的連接通常是共同激活的，因為PC1和PC2的強度呈正相關。已有研究表明，相比于圍繞單一背景狀態的自發波動，這種多狀態的自發活動通常是緩慢且低維的（Goldberg et al., 2004），這與我們的觀察結果一致。

除了水平連接之外，LGN中的自發活動也會影響V1的活動，同時來自高級皮層的自上而下反饋（圖6）亦有貢獻。然而，阻斷視網膜或LGN輸入并不會消除這些模式化的自發活動（Chiu and Weliky, 2001；Smith et al., 2018）。此外，來自高級皮層的反饋通常是特征非特異性的（Stettler et al., 2002）。因此，盡管這兩個因素可能對全局成分有所貢獻，但對于模式化的自發活動而言并非必需。水平連接在這些自發活動模式中起主導作用。

3.2. 自發模式具有普遍性

雙光子鈣成像已被廣泛用于研究多種物種中的自發活動。例如，在小鼠（Goltstein et al., 2015；Mizuno et al., 2018）和大鼠（Ch’ng et al., 2010）中，已有研究表明，具有共同感覺信息偏好的神經元傾向于同步活動。具有共同偏好的神經元之間也存在更強的相互連接（Ko et al., 2011），這些連接在睜眼后以刺激依賴的方式形成（Ko et al., 2013）。這些內部生成的模式通常與刺激誘發的模式具有相似的結構（Mohajerani et al., 2013；Luczak et al., 2015）。在清醒小鼠中，感覺皮層的自發模式還能編碼動物的自發行為，例如面部運動（Stringer et al., 2019）。在雪貂（Smith et al., 2018；Mulholland et al., 2021）和貓（Ch’ng et al., 2010）中，也觀察到了自發的朝向圖。在本研究中，我們除了觀察到朝向圖外，還發現了自發的眼優勢圖和顏色圖。因此，這似乎是一種跨物種的普遍特征。

自發活動與功能結構之間的相關性也在其他感覺皮層中被觀察到。例如，多電極記錄在大鼠聽覺皮層中提供了此類證據（See et al., 2018）；獼猴STP區的皮層腦電圖（ECoG）記錄揭示了自發活動中存在音調拓撲組織（tonotopic organization）（Fukushima et al., 2012）；體感和運動皮層的內源信號光學成像也揭示了功能連接（Card et al., 2022）。在更高級的腦區，例如前額葉皮層（PFC），自發活動也揭示出不同的亞區域（Kiani et al., 2015）。因此，自發活動對功能結構的依賴已在不同腦區、不同物種中被反復觀察到。鑒于這兩者高度相關，我們提出：自發活動中未知的模式可作為發現新功能結構的指標。這對研究高級腦區具有重要的方法學意義——因為這些區域通常過于復雜，難以通過傳統刺激或任務進行有效研究。

3.3. 方法學比較

本研究結果支持我們先前通過內源信號光學成像（ISOI）獲得的發現（Cai et al., 2023）。兩項研究采用了相似的實驗流程，均在V1中發現了三種類型的自發模式：其中朝向和眼優勢模式較強，而顏色模式較弱。在兩項研究中，自發事件的持續時間相近（內源信號：約4秒；鈣信號：圖S2D中為3秒），時間頻率也相似（內源信號：0.02–0.03 Hz；鈣信號：圖1L&M中<0.1 Hz）。因此，本研究結果支持血流動力學信號所觀測到的功能連接（FC）具有神經起源，并證實此類信號在研究介觀尺度功能連接中的有效性（Vasireddi et al., 2016；Card et al., 2022；Cai et al., 2023）。

功能性磁共振成像（fMRI）揭示了大腦中大尺度、長距離的功能連接（Fox and Raichle, 2007）。然而受限于空間分辨率，fMRI無法檢測亞毫米級的功能連接，例如V1內不同朝向模塊之間的連接。電壓敏感染料成像（VSD）、內源信號光學成像（ISOI）和廣域熒光成像等光學方法在揭示介觀尺度功能連接方面非常有用，但無法與單神經元活動直接關聯。雙光子成像則兼具良好的空間與時間分辨率，是研究精細尺度功能連接的重要工具。我們的結果不僅展示了介觀尺度的功能連接，還揭示了一個全局信號（PC1），視野內所有神經元均對其有所貢獻。該全局信號具有緩慢的時間頻率（<0.1 Hz，見圖1L&M），可能對應于fMRI中觀察到的超慢活動（infra-slow activity）（Fox and Raichle, 2007）或廣域鈣成像中的類似信號（Mitra et al., 2018），從而為靜息態BOLD信號提供了細胞層面的支持。

3.4. 本研究的局限性

本研究在麻醉動物中進行。盡管已有研究表明，麻醉與清醒狀態下存在相似的功能連接模式（Vincent et al., 2007），但一些研究也指出，在麻醉動物中，自發模式更強（Omer et al., 2019）。此外，所使用的麻醉藥物類型也可能影響觀測到的功能連接強度（Muta et al., 2023）。近期在清醒動物中進行的大規模記錄揭示了更復雜（更高維）的自發活動，其中部分可能與動物行為相關（參見Avitan and Stringer, 2022綜述）。這些行為或認知因素更具變異性，為自發信號增添了額外的復雜性。相比之下，麻醉動物的自發信號更簡單、更易于分析，可為后續研究提供基線參考。

從信號角度看，我們所分析的鈣信號較慢，且包含閾下神經元活動，與動作電位（spike）信號有所不同。最后，本研究采用的主成分分析（PCA）旨在檢測神經元群體中的共性活動，因此未考察單個神經元的特性。

1. 材料與方法

4.1. 動物本研究
對三只成年獼猴（兩只恒河猴 Macaca mulatta，一只食蟹猴 Macaca fascicularis，分別來自北京協爾鑫生物資源研究所和湖北拓普基因生物科技有限公司）進行了成像。所有實驗操作均遵循美國國立衛生研究院（NIH）指南，并經北京師范大學實驗動物管理和使用委員會（IACUC）批準（批準號：IACUC(BNU)-NKCNL2016–06）。

4.2. 手術流程

動物首先用氯胺酮（ketamine，10 mg/kg）或Zoletil 50（替來他明鹽酸鹽和唑拉西泮鹽酸鹽，4 mg/kg）進行鎮靜。隨后將其固定于立體定位儀上，并通過異氟烷（isoflurane，1.5–2.5%）進行人工通氣麻醉。在枕葉區域實施直徑22–24 mm的圓形顱骨開窗術（craniotomy）及硬腦膜切開術（durotomy），以暴露V1和V2的部分皮層。開窗中心位于中線外側18 mm、后顱骨嵴前14 mm處（圖1A）。

在每只動物中，我們將AAV9.Syn.GCaMP6S.WPRE.SV40病毒（Addgene ，滴度 ≥ 1 × 1013 vg/mL）注射至10–15個皮層位點（每個位點520 nL），注射深度為600–800 μm。隨后，用人工硬腦膜覆蓋暴露的皮層，將原硬腦膜復位并用醫用膠水粘附于人工硬腦膜之上。原顱骨片被放回原位，并用鈦網和骨螺釘固定。頭皮縫合。病毒表達至少8周后，進行第二次手術：重新打開原有顱窗，進行第二輪病毒注射，隨后植入一個光學鈦合金成像腔（內徑/外徑：13/15 mm）。

4.3. 雙光子鈣成像

動物術后恢復后，每隔7–10天進行一次雙光子鈣成像。動物準備流程與手術時基本相同，但頭部需傾斜約45°，以對齊固定的垂直成像光軸。

麻醉方式由異氟烷切換為靜脈輸注丙泊酚（propofol，誘導劑量2 mg/kg，維持劑量2 mg/kg/hr）與舒芬太尼（sufentanil，誘導劑量0.15 μg/kg，維持劑量0.15 μg/kg/hr）的混合液。為防止眼球運動，使用維庫溴銨（vecuronium bromide，誘導劑量0.25 mg/kg，維持劑量0.05–0.06 mg/kg/hr）進行肌肉松弛。通過持續監測心電圖、呼氣末二氧化碳、血氧飽和度和體溫評估麻醉深度。為確保麻醉狀態穩定，成像通常在切換麻醉方式一小時后才開始。

每次成像實驗中，自發活動記錄始終在視覺刺激實驗之前進行。此時猴子雙眼閉合并額外覆蓋眼罩。激光激發波長設為980 nm（Chameleon Ultra II 激光源，Coherent公司）。使用16×物鏡（數值孔徑0.8，Nikon），以1.3 Hz幀率連續采集515 × 512像素的圖像，覆蓋830 × 830 μm的皮層表面（Bruker Ultima IV Extended Reach 系統，Bruker Nano公司）。成像平面位于皮層下180–270 μm深度。自發成像時段通常持續1–2.5小時，期間盡量保持環境黑暗、安靜以減少干擾。

自發成像結束后，打開猴子雙眼，使用托吡卡胺（tropicamide）散瞳，并佩戴合適曲率的隱形眼鏡，使其聚焦于57 cm遠處的刺激屏幕。屏幕上投射光學圓盤以粗略估計中央凹位置。視覺刺激實驗中的圖像采集方式與自發實驗相同。每個視覺刺激呈現1.5秒，間隔0.5秒（即刺激間間隔ISI = 0.5 s），且每次刺激起始時間與圖像幀掃描起始同步。

在成像過程中，觀察到皮層在視野內存在緩慢漂移。在6–8小時的實驗過程中，X-Y平面漂移通常小于100 μm，Z軸方向漂移小于80 μm。我們頻繁檢查細胞形態特征，并相應調整焦平面位置。X-Y平面的漂移在離線數據分析階段進一步校正。

4.4. 視覺刺激

視覺刺激由ViSaGe系統（Cambridge Research Systems Ltd.）生成，并呈現在距眼睛57 cm的21英寸LCD顯示器（Dell E1913Sf）上。刺激屏幕經過伽馬校正，刷新率為60 Hz。通過一對9°棱鏡使左、右眼視野在屏幕上分離，避免重疊；并在兩眼之間放置黑色隔板，防止交叉刺激。黑白光柵刺激中，白色條紋的亮度為100 cd/m2。每次運行中，刺激按隨機順序呈現。

4.5. 用于感受野（RF）定位的刺激

使用直徑2.5°的圓形光柵斑塊，在5 × 5網格位置上呈現。每個光柵為矩形波形（占空比0.2；空間頻率1.5 c/deg；時間頻率8 c/sec），并沿4個不同漂移方向（45°、135°、225°、315°）呈現。每種刺激重復3次（總計5 × 5 × 4 × 3 = 300次試驗）。感受野位置在線分析后用于后續刺激定位。左右眼分別進行映射，所記錄神經元群體的感受野偏心度為3–5°。

4.6. 用于估計神經元眼優勢的刺激

使用7° × 7°的光柵斑塊，分別單眼呈現給左眼或右眼。左右眼各自映射出的感受野中心位置被用作該方形光柵斑塊的中心位置。光柵為矩形波（占空比0.2；空間頻率1.5 c/deg；時間頻率8 c/sec）。刺激采用區組設計（block design），每個區組包含9種條件：4個朝向（0°、45°、9?°、135°）、兩個眼位（左/右眼）以及一個空白對照條件。光柵沿垂直于條紋的方向隨機漂移。通常呈現20–30個區組。

4.7. 用于估計神經元朝向偏好的刺激

與眼優勢刺激類似，也使用光柵斑塊進行朝向測試，不同之處在于左右眼刺激同時通過全屏光柵呈現。每個區組包含17種條件：8個朝向（以22.5°為步長），每個朝向沿兩個相反方向漂移，另加一個空白對照條件。

4.8. 用于估計神經元顏色偏好的刺激
顏色刺激為全屏正弦波光柵（空間頻率 SF = 0.15 c/度，時間頻率 TF = 1 c/s）。每個區組包含29種條件：1個空白對照條件，以及7種不同顏色的光柵，每種顏色分別在4個朝向（0°、45°、90°、135°）上呈現，并沿垂直于光柵條紋的兩個方向中隨機選擇一個方向進行漂移。

這7種顏色分別為：紅色（255,0,0）、黃色（255,255,0）、綠色（0,255,0）、青色（0,255,255）、藍色（0,0,255）、紫色（255,0,255）和白色（255,255,255）。
白色光柵的平均亮度為50 cd/m2，藍色光柵為7 cd/m2，其余所有彩色光柵的平均亮度均為20 cd/m2。

1. 數據分析

5.1. 細胞識別

我們首先使用CalmAn工具箱 v1.9.15（Giovannucci 等，2019）和Python v3.10.8進行運動校正和細胞識別，并獲得各個神經元的熒光強度時間序列。

5.2. 預處理

每個時間序列首先使用Butterworth濾波器（5階，0.005 Hz高通）進行濾波，以去除緩慢漂移的背景信號和呼吸噪聲。隨后，計算熒光變化量 dF/F = (F - F0) / F0，其中 F0 為當前運行中最低10% F值的平均值。

在進行主成分分析（PCA）之前，我們對dF/F序列進行了Z分數標準化，公式為 Z = (dff - dff?) / σdff，其中 dff 是當前幀的dF/F值，dff? 是該序列的平均dF/F值，σdff 是該序列dF/F的標準差。

5.3. 視覺特征偏好

神經元的眼優勢通過Cohen’s D指數評估：D = t / √N，其中 t 為對4個左眼刺激和4個右眼刺激響應的t檢驗值，N 為樣本數。

神經元對16種朝向光柵的反應通過改進的von Mises函數擬合（Mardia, 1972）：y = a? + b?e^c1 × cos(θ - θ_best) + b?e^c1 × cos(θ - θ_best - π)。若神經元的R2 > 0.7，則認為其具有朝向選擇性，并從該擬合函數中提取其最優朝向。

神經元的顏色選擇性通過比較其對每種彩色光柵與黑白光柵的響應（t檢驗）來評估。若t值大于0且p < 0.05，則認為該神經元對該顏色具有選擇性。因此，一個神經元可能對多種顏色均有偏好。

5.4. 功能圖譜

我們為每個成像位點分別獲得了眼優勢、朝向和顏色的功能圖譜。每種功能圖譜均包含兩種類型：單條件圖譜和差異圖譜。以眼優勢圖譜為例，存在兩個單條件圖譜：左眼條件圖譜和右眼條件圖譜，兩者均通過對每個細胞的Z分數取平均得到。差異圖譜則是一個基于左右眼Z分數計算的Cohen D圖譜。對于神經元的功能圖譜，每個神經元被簡化為其原始位置處的一個小圓盤，并賦予上述計算所得的數值。

5.5. 隨機打亂的數據
我們使用相位隨機化（phase-shuffled）的自發活動數據作為對照：首先對每個神經元的Z分數時間序列進行傅里葉變換，然后將頻譜的相位隨機打亂。隨后，將這些經過相位打亂的頻域數據逆變換回時域。這樣生成的打亂后時間序列保留了與原始序列相同的功率譜。

5.6. 主成分分析（PCA）
主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）是一種有用的數據驅動分析工具，常用于fMRI研究（Carbonell et al., 2011）。對于自發活動數據，我們采用兩種方式分別進行降維。第一種如圖2A所示，對Y軸方向（神經元維度）進行降維；第二種如圖4A所示，對X軸方向（幀維度）進行降維。

5.7. 基于PCA結果的SVM分類
為了檢驗自發活動幀與刺激誘發幀之間的相似性，我們結合了PCA與支持向量機（SVM）分類方法。首先，我們在自發活動數據上進行PCA，以降低神經元維度。然后，將刺激條件下獲得的幀投影到該PCA空間中。我們使用前10個主成分維度中的坐標訓練一個SVM分類器（scikit-learn工具箱，v1.3.0）。最后，利用該訓練好的SVM分類器對自發活動幀進行分類。

5.8. 自發活動圖譜
基于上述流程，我們獲得了與刺激誘發幀相似的自發活動幀。連續的一段被分類出的幀被視為一個“事件”（event）。自發活動圖譜可按照與刺激圖譜相同的方式進行計算。

5.9. 爆發性指數（Burstiness Index）
參照Wagenaar等人（2005）所描述的方法，我們通過將整個成像序列劃分為160個時間窗口，來刻畫群體和單細胞活動的爆發性（burstiness）。具體而言，我們計算了在活動最強的前15%時間窗口（本例中為24個窗口）中發生的總事件所占的比例。爆發性指數（BI）定義為：

其中表示在這些前15%高活動窗口中發生的事件占總事件的比例。在均勻分布的假設下，BI趨近于零；而BI值越高，則表明自發活動在時間上具有更強的爆發性。