NAR | 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)賴錦盛教授團(tuán)隊(duì)開發(fā)出新型基因編輯剪刀——CRISPR-Casδ系統(tǒng)

近日，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院賴錦盛教授團(tuán)隊(duì)在國際頂尖學(xué)術(shù)期刊Nucleic Acids Research上發(fā)表重要研究成果，題為Casδ, an evolutionary transitional CRISPR system enables efficient genome editing across animals and plants。該研究從海量微生物數(shù)據(jù)中鑒定出一個全新的CRISPR效應(yīng)蛋白家族Casδ。該系統(tǒng)體積小巧、僅需單鏈crRNA引導(dǎo)，更在動植物基因組編輯中展現(xiàn)出高效、廣譜的應(yīng)用潛力。

在基因編輯領(lǐng)域，CRISPR-Cas12系統(tǒng)因其多樣性和應(yīng)用潛力備受矚目。然而，當(dāng)前主流工具如SpCas9或Cas12a體積龐大、PAM限制嚴(yán)格，而眾多新發(fā)現(xiàn)的小型Cas系統(tǒng)（如Cas12f）往往編輯效率較低或需要復(fù)雜的雙RNA引導(dǎo)機(jī)制，限制了其在動植物育種及基因治療中的應(yīng)用。針對這一瓶頸，研究團(tuán)隊(duì)將目光投向了蘊(yùn)藏著巨大微生物多樣性的宏基因組數(shù)據(jù)，對超過14.7億個蛋白質(zhì)序列進(jìn)行篩查，鑒定到一個全新的蛋白家族Casδ (Delta)。Casδ 與所有已知的Cas12亞型（如Cas12a, b, f, n等）均保持顯著的進(jìn)化距離，被定義為一個全新的Cas12家族。該家族包含三個同源蛋白（Casδ-1, Casδ-2, Casδ-3），其蛋白大小僅為867-936個氨基酸，比Cas12a和Cas12i分別縮小約24%和10%，屬于緊湊型編輯工具。

經(jīng)過生化表征，Casδ-1展現(xiàn)出一系列優(yōu)異特性。與需要crRNA和tracrRNA雙重引導(dǎo)的Cas9或Cas12f不同，Casδ-1僅需一條成熟的crRNA即可完成DNA識別與切割。Casδ-1特異性識別 5’-RYR-3’（R=A/G, Y=T/C）PAM序列。與多數(shù)Cas12偏好T-rich PAM不同，這種偏向嘌呤（A/G）的PAM極大地?cái)U(kuò)展了基因組靶向范圍。

圖1 CRISPR-Casδ核酸酶的鑒定

研究團(tuán)隊(duì)在多個層面驗(yàn)證了Casδ-1的實(shí)際編輯能力，在HeLa細(xì)胞的多個內(nèi)源性基因位點(diǎn)（如AAVS1、HPRT）上，Casδ-1均實(shí)現(xiàn)了高效切割，并產(chǎn)生以長片段缺失（>20bp）為主的編輯結(jié)果。脫靶分析顯示，在預(yù)測的潛在脫靶位點(diǎn)未檢測到編輯活性，表明其具有高特異性。

圖2 Casδ-1實(shí)現(xiàn)人類細(xì)胞多基因位點(diǎn)高效編輯

團(tuán)隊(duì)將Casδ-1成功應(yīng)用于玉米和水稻的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化。在玉米中靶向ZmGL2基因，編輯效率達(dá)到20%，T1代陽性植株表現(xiàn)出預(yù)期的葉片蠟質(zhì)缺失表型。在水稻中靶向OsPDS基因，編輯效率達(dá)到13.3%，基因缺失型突變體表現(xiàn)為白化表型。這充分證明了Casδ-1在單子葉植物中具有強(qiáng)大的內(nèi)源基因編輯能力，為作物基因編輯育種提供了新工具。

圖3 Casδ-1系統(tǒng)在植物基因組編輯中的應(yīng)用

Casδ-1的預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)顯示，它同時保留了祖先蛋白TnpB/Cas12n特有的C末端結(jié)構(gòu)域，以及成熟Cas12b中出現(xiàn)的、被RuvC域分割的NUC結(jié)構(gòu)域。研究團(tuán)隊(duì)猜想Casδ可能處于進(jìn)化路徑的中間點(diǎn)：它已像成熟系統(tǒng)（如Cas12a）一樣，擺脫了對tracrRNA的依賴，僅用crRNA引導(dǎo)；但其C末端結(jié)構(gòu)域尚未完全進(jìn)化，仍對活性有關(guān)鍵作用。基于此，團(tuán)隊(duì)提出了一個基于Casδ的三階段V型CRISPR系統(tǒng)進(jìn)化模型：

• 階段I（原始過渡）：從依賴長鏈ωRNA的TnpB，進(jìn)化到仍需雙RNA（crRNA/tracrRNA）引導(dǎo)的Cas12n。

• 階段II（功能替代）：Casδ作為關(guān)鍵過渡形態(tài)出現(xiàn)，實(shí)現(xiàn)了從雙RNA到單crRNA引導(dǎo)的決定性轉(zhuǎn)變。

• 階段III（系統(tǒng)成熟）：整合適應(yīng)模塊，形成功能完備的Cas12a、Cas12b等成熟系統(tǒng)。

Casδ的發(fā)現(xiàn)如同古生物學(xué)中發(fā)現(xiàn)了連接魚類與陸生動物的“提塔利克魚”，證明了CRISPR從簡單到復(fù)雜的進(jìn)化路徑。

圖4 Casδ-1與其他 Cas12 核酸酶的結(jié)構(gòu)比較與進(jìn)化分析

中國農(nóng)業(yè)大學(xué)玉米生物育種全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室賴錦盛教授、辛蓓蓓副教授、陳建副教授為該論文的共同通訊作者。楊志佳副研究員、博士生余鎂霞、李沛洋和博士后李卓洋為論文共同第一作者。宋偉彬教授、趙海銘教授、趙海楠教授和卞超青年研究員對該工作提供了重要的指導(dǎo)和幫助。該研究工作得到了農(nóng)業(yè)農(nóng)村部項(xiàng)目、國家科技部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、拼多多-中國農(nóng)業(yè)大學(xué)研究基金的資助。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1093/nar/gkaf1358