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《食品科學》：南京工業大學李莎教授等：畢赤酵母高效合成甜味蛋白Brazzein

2025-12-16 14:15:46　來源: 食品科學雜志

北京舉報

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甜蛋白是一類天然存在的甜味蛋白質，其甜度是等濃度蔗糖的千倍甚至萬倍，同時熱量低、甜味持續時間長且可被降解為氨基酸以供人體吸收利用，在食品工業中具有廣泛的應用前景。目前已從自然界的植物中分離出了8 種甜味蛋白，分別為Brazzein、Monelin、Thaumatin、Mabinlin、Pentadin、Curculin、Miraculin與Neoculin。

Brazzein，中文被譯為布拉奇因或巴西甜蛋白，是1994年從非洲西部野生植物

Baillon的果實中分離提純出的一種甜味蛋白質。Brazzein由54 個氨基酸殘基組成，包含8 個半胱氨酸，分子質量為6.5 kDa，其甜度約為等質量蔗糖的2 000 倍，同時具有良好的水溶性。由于Brazzein只能從野生植物的果實中提取得到，且其在果實中的含量較低，傳統種植提取手段成本高昂，因此通過基因工程技術實現天然甜味蛋白的異源表達愈發受到關注，目前研究者們已經在大腸桿菌中實現了Thaumatin的表達，但會導致蛋白以包涵體的形式存在，需要進一步進行復性；Monellin則由重組畢赤酵母在5 L生物反應器中發酵產生，產量達到了2.45 g/L，可以認為真核生物是異源表達甜味蛋白的理想系統。

南京工業大學的高鵬、張勝夢、李莎*等通過優化畢赤酵母

GS115表達系統和搖瓶水平優化，確定最佳誘導條件，并進行啟動子篩選實驗、信號肽適配性驗證與共表達蛋白表達調控元件以進一步提高Brazzein產量。最后在5 L發酵罐中，對發酵工藝與培養基進行優化，以期為Brazzein的工業化生產提供高效技術方案。

1 構建異源表達Brazzein的重組畢赤酵母與搖瓶發酵條件優化

構建得到重組質粒pPIC9K-Bra（圖1a），電轉獲得大量轉化子，提取其基因組后對目的片段進行PCR擴增驗證，結果在650 bp處均顯示目的條帶，測序結果證明無誤，表明

基因被成功整合到畢赤酵母GS115基因組上（圖1b）。重組工程菌進行甲醇誘導表達，離心取上清液進行SDS-PAGE，在6.5 kDa處有明顯的蛋白條帶，與理論分子質量大小一致（圖1c）。經質譜鑒定，為Brazzein的特征肽段。以上結果證實，畢赤酵母異源表達Brazzein的陽性轉化子

-1成功獲得。

-1表達甜味蛋白Brazzein的搖瓶發酵條件進行了單因素優化。甲醇誘導體積分數設置為2.0%時，雖然生物量不是最高，但蛋白質量濃度可達到80.8 mg/L，相比0.5%誘導的產量提升了217.5%（圖1d）；初始生物素體積分數為0.08%時蛋白表達量最高，為82.4 mg/L，且可以保持最高的生物量（圖1e）；發酵溫度為30 ℃時Brazzein表達量最高，達到85.1 mg/L，過高或者過低的溫度都不適宜異源蛋白的表達與生物量的積累（圖1f）；BMMY培養基的初始pH值為6.0時最適宜重組菌生長與目的蛋白表達，表達量提高至90.2 mg/L，實現了蛋白表達與生物量積累的平衡（圖1g）。經4 個單因素的發酵條件優化，Brazzein在搖瓶水平上表達量提升了254.3%。

2 Brazzein異源表達的啟動子優化

基于畢赤酵母

GS115基因組和文獻報道，挖掘獲得6 種內源性誘導型啟動子（PAOX1、PCAT1、PADH3、PFLD1、PDAS1、PFDH1）和3 種內源性組成型啟動子（PGAP、PKAR2-1U＋GCW、PKAR2-3U＋GCW），構建了目的基因

的表達質粒pPIC9K-pro-

（圖2a），并轉化構建重組菌

-1～9。在誘導表達后取樣檢測OD600和發酵上清液的蛋白質量濃度，并進行SDS-PAGE分析，結果如圖2b所示，各啟動子優化菌株的蛋白表達效率如圖2c所示。發酵結果表明經過120 h的誘導后，PAOX1優化菌株的Brazzein表達量最高，達到90.21 mg/L，且生物量最低，

-1重組菌具有最強的單位菌體表達水平，這也預示著PAOX1在后續菌株改造中最富有潛力，劉超等使用PAOX1與其他6 種強啟動子異源表達人源III型膠原蛋白，結果表明PAOX1較其他強啟動子具有更高的表達效率與濃度，本研究結論基本與其相符。相比之下，PADH3、PFLD1和PCAT1表達效果均不佳，這可能由于不同啟動子與目的蛋白的適配性有關。因此，后續仍然以PAOX1作為Brazzein誘導型啟動子的菌株

-1進行實驗。

3 Brazzein異源表達的信號肽適配性優化

信號肽是位于蛋白質N端的一段氨基酸序列，在蛋白分泌表達中扮演著至關重要的角色。經挖掘得到6 個外源信號肽（Sα-factor、SαΔ57-70、SLysozyme、SeSIG、Sost1、Sost1-proα）和3 個內源信號肽（Sdan4、Sdddk、Smsb2）（圖3a），分別構建重組菌

-10～17。結果表明（圖3b、c），S α-factor 、S ost1-proα 、S Lysozyme 、S eSIG 和S msb2 對Brazzein的分泌表達效果基本一致，表達量均在79.5～85.8 mg/L之間。而重組菌K. phaffii Bra-11上基于S α-factor 改造的S αΔ57-70 表達量最佳，達到183.2 mg/L，相比S α-factor 的表達水平提高了約113%，且生物量可以維持在一個較高的水平。S α-factor 第57～70氨基酸的突變使信號肽中第3段

-螺旋部分缺失，增加了信號肽環區的柔性，該柔性有利于信號肽與內質網上的受體更好地相互作用，且信號肽能夠更有效地與新合成蛋白質相互作用，幫助它正確高效地進行跨膜運輸，從而促進蛋白的表達。相較于S α-factor 改造策略，S ost1-proα 的組合式改造策略也有所提高，S ost1-proα 是通過將S α-factor 的前區序列替換為S ost1 的前區序列，相比原始S ost1 能夠更有效地促進目的蛋白質的翻譯后轉位進入內質網，從而提高分泌效率，但在本研究中表達量仍與S α-factor 相差不大。另外，2 個內源信號肽S dan4 和S dddk 不適用于Brazzein的分泌表達，相比S α-factor 下調62.5%和53.7%。因此，選取以S αΔ57-70 替代S α-factor 作為Brazzein的分泌信號肽的重組菌

-11進行下一步研究。

4 蛋白結構修飾及內質網壓力釋放對Brazzein異源表達的影響

蛋白二硫鍵異構酶（PDI）能夠催化蛋白質中二硫鍵的形成、斷裂和重排，從而促進蛋白質的正確折疊；轉錄因子Hac1在內質網中積累大量未折疊或錯誤折疊的蛋白質時，被激活并轉移到細胞核，誘導蛋白質折疊相關基因的表達；伴侶蛋白BiP在蛋白質轉運到內質網的過程中發揮重要作用，防止新合成的蛋白質在轉運過程中變性或斷裂，3 種蛋白表達調控元件在蛋白分泌表達過程中的具體機制如圖4a所示。

-11作為對照菌株，與分別整合分子伴侶和轉錄因子PDI、Hac1、BiP的

-18～20菌株進行比較。對照菌株表達量為175.1 mg/L，整合PDI的菌株

-18表達量為209.3 mg/L，相比之下提升19.5%，而整合

的菌株

-20表達量變化不顯著，且3 種分子伴侶和轉錄因子對于生物量的影響也不顯著（圖4b、c）。PDI可以通過催化二硫鍵的形成和異構化，幫助異源蛋白在內質網中正確折疊，從而提高蛋白的表達量，如共表達PDI可以使抗體蛋白2F5 Fab在畢赤酵母中的表達水平提高2 倍，因此選擇重組菌

-18進行后續的發酵罐放大驗證，以評估其在高密度發酵中的生長性能和產物生成能力。

5 5L發酵罐高密度培養表達Brazzein工藝優化

5.1 甲醇誘導起始生物量對Brazzein表達量的影響

通過調整甘油補料時間的長短控制誘導前發酵罐中畢赤酵母的生物量（以OD600表征），以重組工程菌

-18為研究對象，考察不同初始生物量（OD 600 ＝100或200）進行甲醇誘導對Brazzein表達量的影響。結果表明，誘導起始OD 600 為200時，表達量可在108 h到達峰值，約為0.7 g/L，而當誘導起始OD 600 為100時，蛋白前期積累速度較慢，但表達量可以在114 h達到約1.0 g/L，并且在相同時間點產蛋白的速率均為最高（圖5）。這表明起始生物量較高并不一定能提高異源蛋白的表達量，即使在誘導初期效果也不一定好，這可能由于畢赤酵母高密度發酵對于DO的要求較高，生物密度大造成傳氧受阻。因此，后續研究中甲醇誘導起始生物量OD 600 定為100。

5.2 發酵過程pH值調控對Brazzein表達量的影響

研究表明，畢赤酵母適宜生長的pH值較為寬廣，在pH 3～7的范圍內均能保持良好的生長趨勢，但為了高效表達異源蛋白，發酵pH值一般控制在6左右。因此，本研究在確定初始生物量的基礎上，通過流加氨水控制發酵過程pH值分別為4、5、6和7，考察其對

-18菌株表達Brazzein產量的影響。結果表明，pH 4、5、6和7的最高表達量分別為1、1.4、1.1、0.9 g/L（圖6）。這表明pH值遠離7時，促進Brazzein的分泌表達，這可能是由于Brazzein的等電點為6.98，發酵液pH值遠離等電點有利于Brazzein的可溶性表達。但過于酸性的環境，降低了重組菌在發酵后期（96～126 h）的生長狀態與蛋白表達量，其OD 600 值低于pH值為6時的數值。因此，選擇將發酵過程pH值控制在5。

5.3

-18菌株高密度發酵表達Brazzein的生產初探

由于BMGY培養基中含有酵母提取物、YNB、蛋白胨等昂貴的氮源，規模化生產培養基成本較高，而BSM培養基成分則相對簡單，主要包含無機鹽、甘油等基本營養物質，可以顯著降低原料成本。以重組工程菌

-18為研究對象，根據上述優化的條件采用BSM培養基進行高密度發酵的研究，結果如圖7所示，可以在126 h獲得1.2 g/L的產量，略低于BMGY培養基的表達效果，但可以實現更高的生物量積累，如若后期再進行適配性代謝及發酵過程優化，那么使用BSM工業化培養基生產甜味蛋白Brazzein的潛力很大，另一方面也表明本研究創制的這株重組菌具有多元的發酵適應性，可適用于多種培養基配方。

通過畢赤酵母宿主表達體系組合優化及發酵過程強化，本研究在5 L生物反應器中，以BMGY和BSM為培養基，通過分批補料策略，分別獲得1 440、1 220 mg/L的Brazzein表達量，相較于搖瓶水平使用

GG799作為表達宿主的104 mg/L表達量和發酵罐水平使用

GS115作為表達宿主的1 000 mg/L表達量提升明顯（表2）。

5.4 重組Brazzein的純化與鑒定

因為發酵液上清在50 kDa附近存在一定的雜蛋白條帶，所以離心后取上清液，使用分子質量10 000 kDa的超濾管截留剩余雜蛋白，通過圖8可知，最終可以獲得純度較高的目的蛋白。

質譜分析結果中匹配到4 條注釋序列：CQLANQCNYDCK、KVYENYPVSK、SGECFYDEKR、VYENYPVSKCQLANQCNYDCK（表3），序列覆蓋度為94%，說明畢赤酵母中表達的蛋白與目標蛋白Brazzein相匹配。

隨機提供給志愿者A、B、C、D、E 5 種樣品，對不同質量濃度的重組蛋白Brazzein和蔗糖進行雙盲感官檢驗，通過排序法按照甜度高低對樣品進行排序。由評價結果可知（表4），有8 名志愿者認為75 μg/mL的蛋白樣品溶液甜度與10 000 μg/mL蔗糖無明顯差異，因此計算可得重組蛋白Brazzein的甜度約為等質量蔗糖的150 倍，與目前已知最高產量為等質量蔗糖的40 倍的甜度結果相比，本研究結果較其提升275%。另外，雖有2 位志愿者認為重組蛋白Brazzein的甜度介于100～150 倍之間，但其后味與持久性顯著強于蔗糖。目前已知甜味蛋白Brazzein甜度約為等質量蔗糖的2 000～3 000 倍，實驗結果與其存在一定差距，可能的原因是畢赤酵母表達系統存在的糖基化修飾，會影響眾多外源蛋白的活性，另外甜味蛋白的甜味依賴其正確的構型，共表達PDI后雖然可以實現甜味蛋白Brazzein的高效表達，但仍缺少其構型與天然來源蛋白構型的對比，這依賴于異源重組表達與天然表達Brazzein的晶體結構差異分析，后續也需要研究畢赤酵母的糖基化、磷酸化等修飾機制與甜度的關系，通過基因工程或發酵條件優化，調整修飾模式和程度，使甜蛋白的修飾更接近天然狀態，提升甜度。

結論

甜味蛋白作為非糖甜味劑，其甜度是等濃度蔗糖的千倍以上，同時熱量低、甜味持續時間長且可被降解為氨基酸以供人體吸收利用，因此具有廣闊的發展前景。本研究成功構建了畢赤酵母重組工程菌

-1，并對其進行了系統地發酵過程單因素優化。證實2.0%的甲醇、0.08%的初始生物素、30 ℃的培養溫度和6.0的初始pH值能夠顯著提高搖瓶條件下Brazzein的表達量。進一步的研究中，通過替換和改造啟動子及信號肽，確定了啟動子P AOX1 和信號肽S αΔ57-70 為最優選擇，進一步共表達分子伴侶PDI后獲得了顯著提高Brazzein表達量的畢赤酵母重組工程菌

-18。擴大生物反應器規模至5 L，通過優化發酵起始生物量和誘導期pH值后獲得1.4 g/L的蛋白表達量，并探索了BSM工業化培養基在甜味蛋白表達中的潛力，最終可以獲得1.2 g/L的產量，本研究為進一步推動甜味蛋白走向工業化生產提供了異源表達強化策略和優質的發酵種質資源。

本文《畢赤酵母高效合成甜味蛋白Brazzein 》來源于《食品科學》2025年46卷第17期111-119 頁，作者：高鵬，張勝夢，孫元偉，黃巍巍，邱益彬，徐虹，張琦，李莎* 。 DOI: 10.7506/spkx1002-6630-20250311-087 。點擊下方閱讀原文即可查看文章相關信息。

實習編輯：林安琪；責任編輯：張睿梅。點擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網

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