動物行為實驗指南丨氣味跨度任務測試方法及注意事項

氣味跨度任務（OST）用于研究嚙齒動物的嗅覺工作記憶能力。該任務最初由Dudchenko等人開發，旨在使用不同氣味研究非空間工作記憶，以及海馬損傷對大鼠在該任務中表現的影響。自開發以來，氣味跨度任務的不同變體已被用于研究健忘藥物、興奮藥物以及其他影響記憶和學習的藥物在動物模型中的行為藥理學。由于氣味識別能力和記憶力的下降是最早出現的癥狀之一，氣味跨度任務顯示出了作為阿爾茨海默病和精神分裂癥等疾病生物標志物的潛力。它還可用于測試治療神經系統疾病的新型化合物。

氣味跨度任務是一種遞增的非匹配樣本任務，在該任務中，每次正確反應后，需要記住的刺激數量（跨度）都會增加。實驗對象會接觸一系列氣味刺激，并且對新刺激的選擇會得到強化。該任務在一個方形平臺上進行，平臺周邊標記有24個位置，用于放置裝有帶氣味沙子的杯子，以此作為氣味刺激源。實驗會記錄跨度長度和任務執行過程中出現的錯誤，以便進行分析。

儀器與設備

氣味跨度任務在一個黑色的方形平臺上進行，平臺由四條腿支撐，距離地面39英寸。在測試小鼠時，平臺尺寸為2.5英尺×2.5英尺×2.5英尺，平臺周邊有1英寸高的邊框；測試大鼠時，平臺尺寸為3英尺×3英尺×3英尺，邊框高1.25英寸。平臺周邊標記有24個位置，平臺的每個角落有4個位置，每條邊上等間距分布著5個位置，且都帶有魔術貼條。使用由透明丙烯酸制成的杯子來盛放帶氣味的沙子混合物，杯子直徑為6.5厘米，高3.5厘米。杯子底部也附有一塊魔術貼，這樣便于將杯子放置在平臺上，同時也能防止在實驗過程中杯子翻倒。帶氣味的沙子是由0.5克氣味物質與100克無味的操場用沙混合而成的。也可以用木屑代替無味的操場用沙。在該任務中，使用了25種不同的氣味來制作帶氣味的混合物，例如可可、孜然、橙子、檸檬、芹菜、百里香、羅勒、茴香、辣椒粉、歐芹、多香果、咖啡、蒔蘿、丁香、墨角蘭、薄荷、肉桂、牛至、茶、生姜、大蒜、葛縷子、茴芹、鼠尾草和肉豆蔻。

訓練方案

實驗對象被分組飼養，房間溫度保持在21攝氏度，實行12小時光照/黑暗循環。實驗對象會適度禁食，體重維持在自由進食時體重的85%，在整個訓練和測試過程中可自由飲水。對實驗對象的訓練和測試在光照階段進行。每次實驗開始和結束時，都要用100%的乙醇清潔平臺，以去除任何可能影響實驗對象在任務中表現的不必要刺激。

在訓練前，讓實驗對象連續3天每天適應被處理10分鐘。將無味的操場用沙放入一個杯子中，并在里面埋入10顆獎勵顆粒。將杯子隨機放置在平臺上。從實驗對象的籠子中取出一只，放在平臺上。讓實驗對象挖掘、取出并吃掉所有的獎勵顆粒。然后將實驗對象放回它的籠子。

第二天，取100克無味的操場用沙，與18顆碾碎的獎勵顆粒混合。取兩份各5克的這種混合物分別放入兩個杯子中，只在其中一個杯子里埋入5顆獎勵顆粒。將杯子隨機放置在平臺上。從實驗對象的籠子中取出一只，放在平臺上。讓實驗對象挖掘、取出并吃掉所有5顆獎勵顆粒。然后將實驗對象放回它的籠子。立即用裝有獎勵顆粒的同一個杯子重復這個過程。

氣味非匹配樣本任務

樣本階段：在樣本階段，將一個裝有隨機選擇的帶氣味沙子的杯子（里面埋有一顆獎勵顆粒）隨機放置在平臺上的一個位置。將實驗對象放在平臺上，讓它挖掘、取出并吃掉獎勵顆粒。一旦實驗對象吃掉獎勵顆粒，就將其取出并放入一個不透明的桶中。將杯子移到平臺另一側的新位置。在平臺上的另一個隨機位置放置第二個杯子，里面裝有另一種隨機選擇的帶氣味沙子，同樣埋有一顆獎勵顆粒。

選擇階段：在實驗的選擇階段，將實驗對象放在平臺上，讓它挖掘、取出并吃掉第二個杯子里的獎勵顆粒。取出實驗對象并放入不透明的桶中。同時，取出第一個帶氣味的杯子，并將第二個帶氣味的杯子移到平臺上的隨機位置。

在平臺上的隨機位置放置第三個杯子，里面裝有隨機選擇的帶氣味沙子，埋有一顆獎勵顆粒。將實驗對象放在平臺上，讓它挖掘、取出并吃掉第三個杯子里的獎勵顆粒。取出實驗對象并放入不透明的桶中。同時，取出第二個帶氣味的杯子，并將第三個帶氣味的杯子移到平臺上的隨機位置。在平臺上的隨機位置放置第四個杯子，里面裝有隨機選擇的帶氣味沙子，埋有一顆獎勵顆粒。

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將實驗對象放在平臺上，讓它挖掘、取出并吃掉第四個杯子里的獎勵顆粒。使用樣本階段和選擇階段重復這個過程，每次都引入一種新的帶氣味沙子。每天進行總共10到12次非匹配樣本實驗，持續3天，或者直到實驗對象每次都能可靠地選擇新的氣味為止。使用的氣味是隨機選擇的，3天后，實驗對象應該已經接觸過所有25種氣味。

氣味跨度任務：每個跨度實驗都由樣本階段和選擇階段組成。

在樣本階段，將一個裝有隨機選擇的帶氣味沙子的杯子（里面埋有一顆獎勵顆粒）隨機放置在平臺上的一個位置。將實驗對象放在平臺上，讓它挖掘、取出并吃掉獎勵顆粒。實驗對象吃掉獎勵顆粒后，將其取出并放入不透明的桶中。將第一個杯子移到平臺上的隨機位置。在平臺上的另一個隨機位置放置第二個杯子，里面裝有隨機選擇的帶氣味沙子，埋有一顆獎勵顆粒。在選擇階段，將實驗對象放在平臺上，讓它挖掘、取出并吃掉獎勵顆粒，然后再將其放回不透明的桶中。如果實驗對象開始挖掘第一個杯子，立即將其取出并放入不透明的桶中，然后重新開始實驗。

接下來，在平臺上的隨機位置引入第三個杯子，里面裝有隨機選擇的帶氣味沙子，埋有一顆獎勵顆粒。將第一個和第二個杯子移到平臺上的不同位置。將實驗對象放在平臺上，讓它挖掘、取出并吃掉獎勵顆粒，然后再將其放回不透明的桶中。繼續這個過程，在平臺上的隨機位置添加一個新的隨機選擇的帶氣味沙子（里面埋有一顆獎勵顆粒），并且每次實驗對象通過選擇帶獎勵的沙子做出正確決定時，就將之前采樣的帶氣味沙子的杯子移到新的位置。如果實驗對象選擇了之前采樣過的杯子，實驗就終止，并從平臺上只有一個帶氣味沙子的杯子開始重新進行一個新的跨度實驗。在連續4天的測試期間，讓實驗對象在15到20分鐘內（進行2到5次實驗）盡可能多地進行跨度實驗。

十二氣味跨度任務

當實驗對象在連續2天內平均跨度達到5，或者至少經歷了20次實驗階段后，氣味跨度任務完成，此時實驗對象進入測試的最后階段。在這個任務中，連續7天每天讓實驗對象進行一次跨度實驗，樣本階段和選擇階段與上述氣味跨度任務的描述相同，直到呈現出12種氣味為止。如果實驗對象做出了錯誤的選擇，允許它探索平臺上的其他帶氣味的杯子，直到它選擇到正確的帶氣味杯子（里面有獎勵）。通過添加新的帶氣味沙子繼續實驗，直到對所有12種氣味都進行了采樣。

探測實驗階段：可以使用兩個探測實驗階段進行驗證。

探測實驗一（獎勵）：該實驗用于驗證實驗對象在解決任務時是利用帶氣味沙子的氣味，而不是獎勵顆粒的氣味。在這個實驗階段，實驗的進行方式與氣味跨度任務中描述的相同，但杯子里不埋任何獎勵顆粒。只有當實驗對象通過開始挖掘正確的杯子做出正確選擇時，才給予獎勵。

探測實驗二（杯子更換）：該實驗用于驗證實驗對象是否通過標記杯子或沙子來完成任務。在這個實驗階段，實驗的進行方式與氣味跨度任務相同。在實驗過程中的兩個時間點，當平臺上有5個杯子（跨度為4）和9個杯子（跨度為8）時，用裝有相同氣味的新沙子和新杯子替換所有的沙子和杯子。

通過氣味跨度任務評估工作記憶：對之前用于大鼠的氣味跨度任務進行了修改，以研究轉基因小鼠的工作記憶。使用過表達人類半胱天冬酶-3（一種在整個嗅覺系統中大量存在的凋亡蛋白）的小鼠。研究表明，與野生型小鼠相比，轉基因小鼠存在明顯的嗅覺工作記憶缺陷，表現為跨度長度縮短、準確率降低和錯誤率升高。用于增強小鼠注意力的尼古丁可以逆轉嗅覺工作記憶缺陷。該任務可用于神經系統疾病的動物模型，并測試不同的治療方法，因為它可以檢測到基因改造動物嗅覺工作記憶的細微變化。小鼠的氣味跨度任務可以作為開發人類工作記憶測試的基礎，并且可以作為阿爾茨海默病和精神分裂癥等疾病的早期生物標志物，因為氣味識別和記憶缺陷是最早觀察到的癥狀之一。

評估興奮藥物對氣味跨度任務表現的影響：使用了氣味跨度任務的修改版本來測試氟硝西泮、氯胺酮、甲基苯丙胺和哌醋甲酯等興奮藥物對大鼠表現的影響。這四種藥物都產生了劑量依賴性的表現損傷，表現為跨度長度、最長連續正確次數和總體準確率的下降。甲基苯丙胺和哌醋甲酯在中高劑量時會縮短跨度長度和最長連續正確次數，這與這些藥物用于治療注意力缺陷多動障礙（ADHD）以增強工作記憶和注意力的事實相悖。氯胺酮的研究結果顯示，與氟硝西泮在多只大鼠中產生選擇性損傷不同，它只在兩只大鼠中產生了選擇性影響?？傮w而言，該研究結果表明，氣味跨度任務可用于記憶方面的行為和藥理學分析。

數據分析

• 跨度/跨度長度：依次呈現且無錯誤選擇的杯子數量減1。

• 完成的跨度總數。

• 準確率百分比

• 平均跨度延遲時間

氣味跨度任務設置簡單，運行所需的設備很少。所使用的裝置易于清潔和維護。測試方案可以修改，并應用于從行為藥理學到研究基因改造動物工作記憶的各個研究領域。

文章引用：

• Dudchenko PA, Wood ER, Eichenbaum H (2000). Neurotoxic hippocampal lesions have no effect on odor span and little effect on odor recognition memory but produce significant impairments on spatial span, recognition, and alternation. Journal of Neuroscience 20(8), 2964-77.

• Young JW, Kerr LE, Kelly JS, Marston HM, Spratt C, Finlayson K, Sharkey J (2007). The odour span task: a novel paradigm for assessing working memory in mice. Neuropharmacology. 52(2), 634-45.

• Galizio M, April B, Deal M, Hawkey A, Panoz-Brown D, Prichard A, Bruce K (2016). Behavioral pharmacology of the odor span task: Effects of flunitrazepam, ketamine, methamphetamine and methylphenidate. Journal of the Experimental Analysis of Behavior 106(3), 173-194.

• Galizio M, Mathews M, Mason M, Panoz-Brown D, Prichard A, Soto P (2017). Amnestic drugs in the odor span task: Effects of flunitrazepam, zolpidem and scopolamine. Neurobiology of Learning and Memory 145, 67-74.

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