《食品科學(xué)》：華南農(nóng)業(yè)大學(xué)黎攀副教授等：基于秀麗隱桿線蟲模型的檳榔堿運動神經(jīng)毒性效應(yīng)及機制

檳榔是棕櫚科（Palmaceae）檳榔屬中的一種常綠喬木植物干燥成熟種子。嚼食檳榔能夠帶給人興奮、愉悅的感覺。是因為檳榔中的檳榔堿是一種具有刺激作用的生物堿，但現(xiàn)已有研究證明檳榔堿對人體具有一定的毒性作用，過量攝入檳榔堿會影響口腔環(huán)境穩(wěn)定性，可能導(dǎo)致口腔疾病，進(jìn)而誘發(fā)口腔鱗狀細(xì)胞癌及口腔黏膜下纖維性變等。

秀麗隱桿線蟲是一種以尿嘧啶合成缺陷大腸桿菌

Escherichia coli

華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院的王玥、鄒澤斌、黎攀*等人以秀麗隱桿線蟲為模型，結(jié)合其完整的神經(jīng)肌肉系統(tǒng)和遺傳可操作性，系統(tǒng)分析檳榔堿對運動能力、代謝途徑及神經(jīng)元損傷的多維毒性效應(yīng)，以期為揭示檳榔堿的神經(jīng)毒性機制提供了新的視角。

1 檳榔堿對秀麗隱桿線蟲運動能力的毒性作用

線蟲的行動力實驗不僅能夠直接反映出線蟲的運動能力變化，還可以判斷其整體健康狀況、神經(jīng)系統(tǒng)功能、代謝狀態(tài)以及環(huán)境毒性情況等。如圖1所示，線蟲的行動能力在檳榔堿刺激后發(fā)生下降，且檳榔堿的質(zhì)量濃度越高，線蟲行動能力下降越明顯。使用2 mg/mL的檳榔堿刺激線蟲，16 d后超80%的線蟲受到觸碰后不發(fā)生運動，已喪失擺動身體的運動能力，而Control組線蟲卻仍能夠自發(fā)地做正弦運動，表明檳榔堿能夠?qū)€蟲的運動能力產(chǎn)生顯著的影響。對線蟲4 d時身體彎曲、頭部擺動和咽泵頻率進(jìn)行觀測也證實線蟲行動的積極性降低，同時降低的趨勢隨著檳榔堿質(zhì)量濃度的增加逐漸明顯。這些結(jié)果均表明，檳榔堿的刺激對線蟲的運動能力有毒性作用，能夠?qū)€蟲整體的健康狀況造成影響。

2 檳榔堿對秀麗隱桿線蟲氧化還原平衡及脂褐質(zhì)積累毒性作用

秀麗隱桿線蟲的氧化應(yīng)激系統(tǒng)紊亂可由多個生理指標(biāo)體現(xiàn)。氧化應(yīng)激是由于細(xì)胞內(nèi)自由基（包括超氧陰離子自由基、過氧化氫等）產(chǎn)生過多，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡失調(diào)而產(chǎn)生的不良反應(yīng)，這種平衡失調(diào)可能對線蟲的生理狀態(tài)產(chǎn)生廣泛的影響，涉及到多個方面的生理指標(biāo)，包括線蟲的運動能力方面。本研究通過測定線蟲體內(nèi)抗氧化酶（GSH、CAT、SOD）活性及氧化物質(zhì)水平（MDA、ROS）評估檳榔堿對線蟲氧化應(yīng)激系統(tǒng)的毒性作用。如圖2所示，與Control組相比，檳榔堿的刺激在不同程度上降低了線蟲抗氧化酶活性，2 mg/mL檳榔堿作用下線蟲GSH、CAT及SOD活性較Control組分別下降29.41%、31.02%、34.22%。線蟲機體的抗氧化防御系統(tǒng)被破壞，導(dǎo)致線蟲體內(nèi)MDA和ROS的積累增加，60 min時AEC-2組、AEC-4組ROS的相對含量較Control組分別增加了77.68%、106.28%。由此可以看出，在檳榔堿的刺激下線蟲體內(nèi)的氧化還原平衡被打破，檳榔堿造成線蟲體內(nèi)抗氧化酶活性降低、氧化自由基積累，從而導(dǎo)致機體的過氧化損傷，造成機體疲勞，運動能力下降。

脂褐質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)熒光色素顆粒，這種物質(zhì)與線蟲抗氧化水平密切相關(guān)，指示衰老細(xì)胞內(nèi)由氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷，也可能導(dǎo)致線蟲行動能力受損。本研究將檳榔堿刺激后的線蟲在倒置熒光顯微鏡下通過DAPI濾片拍攝圖片，并在ImageJ中分析其熒光強度并統(tǒng)計，在0.5、1、2、4 mg/L檳榔堿刺激下，脂褐質(zhì)平均熒光強度較Control組分別顯著提高了13.50%、16.61%、29.01%、29.59%（圖3）。結(jié)果表明，檳榔堿的刺激導(dǎo)致線蟲體內(nèi)脂褐質(zhì)過度積累，且積累量隨檳榔堿質(zhì)量濃度增加而升高，這可能與線蟲的氧化防御系統(tǒng)受損有關(guān)。氧化防御系統(tǒng)受損會引起色素沉積并加速衰老，從而影響代謝，間接降低線蟲的運動能力。

3 檳榔堿對秀麗隱桿線蟲腸道屏障功能毒性作用

秀麗隱桿線蟲的腸道是其主要的消化和吸收器官，由細(xì)胞間連接構(gòu)成管壁，腸道的結(jié)構(gòu)相對簡單。腸道在線蟲自身的免疫調(diào)節(jié)、信號傳遞、環(huán)境應(yīng)激反應(yīng)中發(fā)揮作用，一旦腸道屏障出現(xiàn)破損，將會影響到線蟲包括運動在內(nèi)的多項正常能力。因此，本研究通過亮藍(lán)將線蟲腸道染為藍(lán)色觀察線蟲腸道屏障的完整性，當(dāng)腸道屏障功能完整時，染色劑不會溢出腸道，藍(lán)色會集中在線蟲腸道內(nèi)部，而當(dāng)腸道屏障功能受損時，染色劑溢出，藍(lán)色會遍布線蟲全身。分別對各組腸道屏障完整線蟲的占比進(jìn)行統(tǒng)計（圖4），其中，Control組線蟲的腸屏障完整性占比超過80%，檳榔堿刺激后的線蟲腸屏障顯著受損（P＜0.001），且有濃度依賴趨勢，0.5 mg/mL檳榔堿作用下腸屏障完整性下降25.29%，質(zhì)量濃度提至4 mg/mL時腸屏障完整性下降58.42%。結(jié)果說明，檳榔堿對線蟲的腸屏障有一定的破壞作用，且隨著檳榔堿質(zhì)量濃度的提高，作用效果越明顯，而腸道屏障受損會導(dǎo)致細(xì)菌、毒素更易入侵機體，引發(fā)線蟲的腸道炎癥，炎癥會加強機體的氧化應(yīng)激，從而導(dǎo)致線蟲行動力下降。

4 檳榔堿對秀麗隱桿線蟲產(chǎn)能代謝的毒性作用

線蟲的運動離不開ATP提供足夠的能量。機體通過分解糖原得到葡萄糖（葡萄糖的合成代謝），葡萄糖進(jìn)一步分解得到丙酮酸（葡萄糖的分解代謝），丙酮酸最終進(jìn)入TCA循環(huán)反應(yīng)生成ATP（TCA循環(huán)），為機體提供能量，此為一個完整的線蟲產(chǎn)能代謝過程。

4.1 葡萄糖的合成代謝

葡萄糖是生物體的主要能量來源之一，葡萄糖的合成代謝過程有很多種，其中糖原作為一種動物體內(nèi)的多糖，在機體需要時會分解成葡萄糖并為機體提供能量。因此可以通過測定線蟲體內(nèi)糖原及葡萄糖含量評估線蟲體內(nèi)的產(chǎn)能代謝情況。本研究利用碘對線蟲體內(nèi)的糖原染色，并測定了線蟲體內(nèi)的糖原水平，結(jié)果如圖5所示，在低質(zhì)量濃度的檳榔堿刺激下，線蟲體內(nèi)糖原含量升高，可能是由于檳榔堿在此質(zhì)量濃度下抑制了糖原的分解代謝。然而，隨著檳榔堿質(zhì)量濃度的進(jìn)一步提升，線蟲腸屏障功能受到破壞，導(dǎo)致營養(yǎng)吸收受阻，無法獲得足夠的物質(zhì)用于糖原合成，最終使體內(nèi)糖原含量顯著下降。與此同時，本研究測定了線蟲體內(nèi)葡萄糖含量，以進(jìn)一步觀察其葡萄糖合成代謝情況。結(jié)果顯示，檳榔堿刺激顯著降低了線蟲的葡萄糖水平，當(dāng)檳榔堿質(zhì)量濃度達(dá)2 mg/mL時，葡萄糖含量較Control組下降了36.94%。這一現(xiàn)象表明檳榔堿可能抑制了線蟲的葡萄糖合成代謝，從而影響其產(chǎn)能代謝，具有一定的毒性作用。

4.2 葡萄糖的分解代謝

葡萄糖的分解代謝主要發(fā)生在細(xì)胞內(nèi)，在糖酵解和三羧酸循環(huán)中，線蟲通過將葡萄糖經(jīng)過一系列分解反應(yīng)生成丙酮酸等中間產(chǎn)物并產(chǎn)生ATP，丙酮酸最終進(jìn)入三羧酸循環(huán)，通過氧化磷酸化反應(yīng)生成ATP，提供細(xì)胞的能量需求。本研究將丙酮酸含量作為衡量線蟲葡萄糖分解程度的指標(biāo)，結(jié)果如圖6所示，在不同質(zhì)量濃度的檳榔堿刺激下，線蟲體內(nèi)丙酮酸含量均顯著降低（P＜0.001），當(dāng)檳榔堿質(zhì)量濃度達(dá)2 mg/mL時，葡萄糖含量較Control組下降了43.11%。結(jié)合圖5，檳榔堿刺激會影響線蟲的葡萄糖合成代謝，導(dǎo)致線蟲體內(nèi)葡萄糖合成量降低，葡萄糖合成的減少意味著分解的減少，線蟲體內(nèi)無法產(chǎn)生足夠多的ATP，從而使得線蟲的運動能量需求無法得到滿足，運動能力下降。

4.3 TCA循環(huán)

三羧酸循環(huán)又稱檸檬酸循環(huán)，是細(xì)胞中將葡萄糖分解成二氧化碳和水的過程中的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，丙酮酸在進(jìn)入循環(huán)后與氧合酮酸結(jié)合形成檸檬酸，之后再經(jīng)過一系列的脫氫和底物磷酸化產(chǎn)生ATP、水和二氧化碳，產(chǎn)生的ATP將為機體提供能量，整個循環(huán)為維持細(xì)胞內(nèi)的能量平衡和物質(zhì)代謝提供貢獻(xiàn)。本實驗測定了TCA循環(huán)的中間產(chǎn)物檸檬酸的含量。如圖7A所示，檳榔堿刺激使線蟲體內(nèi)檸檬酸含量減少，中間產(chǎn)物的減少阻礙了TCA循環(huán)后續(xù)反應(yīng)，導(dǎo)致ATP生成不足。為了驗證這一點，本研究進(jìn)一步測定了ATP水平（圖7B）。結(jié)果顯示線蟲體內(nèi)的ATP含量顯著降低，在較高質(zhì)量濃度的檳榔堿（2 mg/mL）刺激下，線蟲檸檬酸及ATP含量較Control組分別顯著下降37.76%、55.88%（P＜0.001）。ATP作為機體的能量來源，對線蟲的生長發(fā)育、運動、代謝都會產(chǎn)生巨大的影響，檳榔堿刺激導(dǎo)致線蟲體內(nèi)ATP含量下降，無法提供充足的能量維持線蟲代謝、運動，線蟲行動容易變緩變少。

5 檳榔堿對秀麗隱桿線蟲的神經(jīng)元毒性作用

5.1 多巴胺能神經(jīng)元及神經(jīng)遞質(zhì)毒性作用

秀麗隱桿線蟲的神經(jīng)系統(tǒng)包含約302 個神經(jīng)元，這些神經(jīng)元形成一個精密的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，其中，多巴胺能神經(jīng)元的主要功能是合成和釋放多巴胺，這是一種在神經(jīng)系統(tǒng)中起重要調(diào)節(jié)作用的神經(jīng)遞質(zhì)。多巴胺能神經(jīng)系統(tǒng)能夠通過對外界刺激的感知，調(diào)節(jié)線蟲的行為和生理狀態(tài)，與線蟲運動、記憶、學(xué)習(xí)等行為等相關(guān)。在本研究中，通過觀測BZ555線蟲中GFP的熒光強度及所標(biāo)記的神經(jīng)元形態(tài)可以直觀地表征線蟲多巴胺能神經(jīng)元的受損情況。從圖8可以看出，低質(zhì)量濃度檳榔堿刺激下線蟲的多巴胺能神經(jīng)元已出現(xiàn)斷裂。當(dāng)檳榔堿質(zhì)量濃度提高到2 mg/mL時，多巴胺能神經(jīng)元缺失、畸變現(xiàn)象明顯，同時其熒光強度較Control組下降18.70%，多巴胺水平下降24.29%。這些結(jié)果表明，檳榔堿的刺激使得線蟲多巴胺能神經(jīng)元嚴(yán)重受損，多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)的水平降低，活性減弱，這與運動疲勞的發(fā)生密切相關(guān)，提示檳榔堿對秀麗隱桿線蟲運動能力的毒性作用。

5.2 膽堿能神經(jīng)元及神經(jīng)遞質(zhì)毒性作用

膽堿能神經(jīng)元產(chǎn)生和釋放的乙酰膽堿對于調(diào)控神經(jīng)系統(tǒng)的活動至關(guān)重要。膽堿能神經(jīng)元通過突觸連接與感覺神經(jīng)元、運動神經(jīng)元和其他中間神經(jīng)元等相互連接，構(gòu)建復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，使膽堿能神經(jīng)元同樣具有感知環(huán)境、調(diào)控運動、學(xué)習(xí)和記憶等的能力。在本研究中，通過顯微鏡觀察并統(tǒng)計檳榔堿刺激下LX929線蟲膽堿能神經(jīng)元的熒光強度。圖9顯示，與Control組相比，檳榔堿處理后的線蟲膽堿能神經(jīng)元出現(xiàn)明顯的斷裂，神經(jīng)元連接不再連貫，表明檳榔堿導(dǎo)致了膽堿能神經(jīng)元損傷。進(jìn)一步分析熒光強度發(fā)現(xiàn)，隨著檳榔堿質(zhì)量濃度增加，神經(jīng)元熒光強度和體內(nèi)乙酰膽堿水平顯著降低。當(dāng)檳榔堿質(zhì)量濃度達(dá)2 mg/mL時，熒光強度和乙酰膽堿水平分別下降20.71%和32.48%，說明檳榔堿對線蟲膽堿能神經(jīng)元造成損傷，影響乙酰膽堿的產(chǎn)生和釋放。本研究表明檳榔堿對線蟲膽堿能神經(jīng)元具有一定的損傷作用，造成乙酰膽堿神經(jīng)遞質(zhì)水平的下降，已有研究證實多巴胺能神經(jīng)元和膽堿能神經(jīng)元受損引起多巴胺和乙酰膽堿失衡現(xiàn)象，進(jìn)而引起運動功能損傷，同時提示神經(jīng)元之間的連接斷續(xù)，可能與線蟲身體擺動等運動能力下降有關(guān)。

6 檳榔堿對秀麗隱桿線蟲線粒體毒性作用

6.1 線粒體數(shù)量

線粒體是線蟲體細(xì)胞內(nèi)主要的呼吸場所，線蟲通過細(xì)胞呼吸過程產(chǎn)生ATP這一主要能量來源，在線蟲的生長、運動、氧化還原平衡等生命活動起到重要作用。本研究利用GFP標(biāo)記的熒光物質(zhì)分析了PD4251線蟲在檳榔堿刺激下的線粒體數(shù)量變化。通過GFP濾鏡的熒光顯微鏡觀察，線粒體呈現(xiàn)綠色熒光。如圖10所示，檳榔堿的刺激顯著地降低了線蟲體內(nèi)線粒體的數(shù)量，這可能導(dǎo)致細(xì)胞呼吸過程減弱，ATP生成量減少，進(jìn)而降低線蟲的運動能力。

6.2線粒體功能障礙

線粒體是機體重要的產(chǎn)能中心，其功能受損時產(chǎn)能下降，可能導(dǎo)致機體對環(huán)境應(yīng)激的敏感性增加、神經(jīng)傳導(dǎo)受阻以及運動能力下降。由質(zhì)子及其他離子積累和轉(zhuǎn)運產(chǎn)生的不對稱分布引起的線粒體內(nèi)膜電位的改變成為線粒體膜電位，若線粒體功能正常則線粒體膜電位的水平無異常。JC-1是一種用于檢測線粒體膜電位的熒光探針，其在線粒體膜電位高處呈紅色，在線粒體膜電位低處呈綠色，在本研究中，通過分析線蟲體內(nèi)JC-1聚合物和JC-1單體熒光強度，探究線粒體膜電位情況。結(jié)果顯示（圖11），與Control組相比，檳榔堿的刺激使視野內(nèi)紅色區(qū)域范圍減小且亮度減弱，而綠色區(qū)域的占比增加且熒光強度增強。同時，本研究發(fā)現(xiàn)線粒體的膜電位極顯著降低（P＜0.001），線粒體的Na＋K＋-ATP活性降低。以上結(jié)果均說明，線蟲在檳榔堿刺激下線粒體膜電位異常下降，暗示其線粒體功能受損。此時線粒體內(nèi)膜外側(cè)和內(nèi)膜的質(zhì)子梯度被破壞，ATP合酶迅速水解消耗ATP，線蟲無法得到足夠的能量維持運動及其他正常生理功能。

結(jié) 論

本研究以檳榔堿為毒性物，探究其對秀麗隱桿線蟲運動神經(jīng)毒性作用。結(jié)果表明，在檳榔堿的刺激下，線蟲行動力出現(xiàn)顯著降低，線蟲體內(nèi)抗氧化酶活性顯著降低且脂褐質(zhì)水平明顯上升，氧化還原平衡被打破。線蟲腸屏障的完整性明顯下降，葡萄糖的合成和分解代謝受阻，致使線蟲的體內(nèi)ATP生成減少。檳榔堿導(dǎo)致線蟲多巴胺能神經(jīng)元和膽堿能神經(jīng)元受損，同時線蟲線粒體數(shù)量減少，線粒體膜電位異常下降，暗示其線粒體功能受損。綜上所述，檳榔堿對秀麗隱桿線蟲運動神經(jīng)具有明顯的毒性作用，長期攝入檳榔制品可能導(dǎo)致類似線蟲模型的代謝-神經(jīng)損傷，需關(guān)注檳榔消費人群的運動功能障礙風(fēng)險。然而本研究僅從多巴胺能神經(jīng)元、膽堿神經(jīng)元角度揭示了其神經(jīng)毒性的機制，未來還可以從谷氨酸、氨基丁酸、5-羥色胺等角度深入探討檳榔堿對秀麗隱桿線蟲運動神經(jīng)毒性作用機制，以期為后續(xù)建立完整的檳榔堿誘導(dǎo)的秀麗隱桿線蟲運動神經(jīng)模型提供基礎(chǔ)，也可為篩選具有改善檳榔堿運動神經(jīng)毒性作用的活性物質(zhì)提供理論依據(jù)。

作者簡介

通信作者：

黎攀，碩士生導(dǎo)師，現(xiàn)任華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品工程系副主任、廣東省南藥（廣陳皮）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團隊核心成員。主要從事植物來源的活性成分與腸道菌群互作機制、及其抗肥胖、降血壓分子機制等前沿交叉學(xué)科領(lǐng)域的研究。主持廣東重點領(lǐng)域研發(fā)項目子課題、廣東省自然科學(xué)基金面上項目、華南農(nóng)業(yè)大學(xué)青年科技人才培育專項、華南農(nóng)業(yè)大學(xué)高層次人才引進(jìn)青年才俊項目及橫向委托項目10余項，累計項目經(jīng)費超250萬元。共計以第一或通信作者身份在

Food Chemistry, Applied and Environmental Microbiology

H

第一作者：

王玥，碩士研究生，本科就讀于中南林業(yè)科技大學(xué)，碩士就讀于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品工程專業(yè)。參與項目： 一種天麻紅酸湯的制作方法、 一種高勁道面條的開發(fā)。獲得榮譽獎勵：2023年優(yōu)秀畢業(yè)生、2023年校一等獎學(xué)金、2024年校二等獎學(xué)金。

本文《 基于秀麗隱桿線蟲模型的檳榔堿運動神經(jīng)毒性效應(yīng)及機制 》來源于《食品科學(xué)》2025年46卷第19期167-176頁，作者： 王玥，鄒澤斌，李雅琪，杜冰，黎攀 。DOI: 10.7506/spkx1002-6630-20250222-105 。點擊下方 閱讀原文 即可查看文章相關(guān)信息。

實習(xí)編輯：安宏琳；責(zé)任編輯：張睿梅。點擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網(wǎng)