《食品科學(xué)》：江南大學(xué)趙建偉副教授等：芳樟醇的抑菌作用及負(fù)載于納米纖維的性能

在生鮮肉類中常見幾種致病菌，大腸埃希氏菌是典型的革蘭氏陰性兼性厭氧菌，普遍存在于牛肉、雞肉、牛奶等動物來源的食物，可引起嚴(yán)重的食源性腹瀉和敗血癥。金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的溶血素、殺白細(xì)胞素、腸毒素、血漿凝固酶和脫氧核糖酸酶等是引起細(xì)菌性食物中毒的主要原因。莓實假單胞菌是一種革蘭氏陰性菌，廣泛存在于各種冷藏食品中，是肉品、海產(chǎn)品和乳制品的優(yōu)勢腐敗菌。

天然植物精油及其活性化合物在抑制食源性致病菌和腐敗菌方面已引起人們的廣泛關(guān)注。芳樟醇主要來源于芳樟和肉桂，具有防霉、抑菌、抗氧化等作用，對多種食源性致病菌和腐敗菌表現(xiàn)出較好的抑菌效果。芳樟醇在抑菌保鮮包裝中使用時需要有適當(dāng)?shù)膽?yīng)用形式。靜電紡絲方法是現(xiàn)階段唯一能夠?qū)崿F(xiàn)連續(xù)制備微納米材料制備方法，具有制備工藝簡便、紡絲形貌穩(wěn)定可控、可規(guī)模化生產(chǎn)、成本低廉等優(yōu)勢，是納米纖維的首選制備方法。聚己內(nèi)酯（PCL）是一種可生物降解的脂肪族聚酯，靜電紡絲制備的PCL納米纖維具有優(yōu)異的生物相容性，能夠負(fù)載活性生物小分子，并且生產(chǎn)成本低，被廣泛應(yīng)用于緩釋藥物的生產(chǎn)。

江南大學(xué)食品學(xué)院的黃婷、趙建偉*，江南大學(xué)紡織科學(xué)與工程學(xué)院的李大偉等人通過靜電紡絲將PCL制備成納米纖維，并在紡絲過程中將芳樟醇負(fù)載于纖維內(nèi)，既能保持芳樟醇適當(dāng)?shù)臐舛扔帜芫忈尡３殖志玫囊志钚浴＿@種纖維可以多層重疊形成纖維膜，用作生鮮肉類等食品的抑菌包裝材料。通過測定芳樟醇最小抑菌濃度（MIC）、最小殺菌濃度（MBC）、細(xì)菌生長曲線、菌液電導(dǎo)率，探究芳樟醇對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和莓實假單胞菌的抑菌作用，考察芳樟醇對這些細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞程度。選用不同添加量的芳樟醇紡絲液用靜電紡絲法制備PCL-芳樟醇納米纖維膜，將芳樟醇嵌合于PCL纖維中，探究芳樟醇添加量對納米纖維形貌的影響，分析制得的納米纖維膜的力學(xué)性質(zhì)、抑菌性能，以提供芳樟醇作為抑菌劑的有效應(yīng)用方式。

1 MIC

MIC是衡量和評價物質(zhì)抑菌能力的主要指標(biāo)之一。如表1所示，無菌水和甲醇（0 μL/mL）處理的3 種菌液濁度相似，均有大量菌落生長，說明甲醇對3 種細(xì)菌的生長不會引起額外的抑制作用。芳樟醇對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和莓實假單胞菌具有顯著的抑菌作用，當(dāng)芳樟醇的稀釋添加量最小為1.5 μL/mL時，金黃色葡萄球菌和莓實假單胞菌的菌液澄清透明，因此芳樟醇對金黃色葡萄球菌和莓實假單胞菌的MIC為1.5 μL/mL。當(dāng)芳樟醇添加量增加至2.5 μL/mL時，大腸埃希氏菌中仍有少量細(xì)菌生長，而芳樟醇添加量繼續(xù)增加至5 μL/mL時，菌液澄清透明，無細(xì)菌生長，因此芳樟醇對大腸埃希氏菌的MIC為5 μL/mL，抑菌效果隨芳樟醇添加量增大而增加。因此，芳樟醇對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和莓實假單胞菌具有較強抑菌活性，低添加量的芳樟醇處理即可抑制細(xì)菌的生長，抑菌作用隨抑菌劑的添加而逐漸增強，并且體系中的甲醇對細(xì)菌的生長無抑制作用。

2 MBC

如圖2所示，芳樟醇能夠延緩和抑制大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和莓實假單胞菌的生長，且抑菌能力隨著其添加量的增加而增加。甲醇（0 μL/mL芳樟醇）對3 種細(xì)菌的生長未產(chǎn)生抑制效果，在培養(yǎng)基中可以觀察到大量的細(xì)菌菌落。當(dāng)芳樟醇的添加量達到1 μL/mL時，可以觀察到金黃色葡萄球菌和莓實假單胞菌的生長明顯受到一定程度的抑制，在培養(yǎng)基中還是可以觀察到少量菌落的存在。而當(dāng)芳樟醇添加量達到1.5 μL/mL時，可以觀察到金黃色葡萄球菌和莓實假單胞菌的培養(yǎng)基未出現(xiàn)細(xì)菌菌落，表明1.5 μL/mL為芳樟醇對金黃色葡萄球菌和莓實假單胞菌的MBC，可以完全抑制這兩種細(xì)菌的生長。

當(dāng)芳樟醇的添加量達到2.5 μL/mL時，大腸埃希氏菌的培養(yǎng)基上可觀察到少量細(xì)菌，其生長明顯受到一定程度的抑制。當(dāng)芳樟醇的添加量最低為5 μL/mL時，大腸埃希氏菌的培養(yǎng)基上未見肉眼可見的細(xì)菌生長，表明芳樟醇對大腸埃希氏菌的MBC為5 μL/mL。MBC實驗結(jié)果表明芳樟醇對以上食源性致病菌和腐敗菌具有優(yōu)異的殺菌活性，其中，對革蘭氏陽性菌和生鮮肉制品的腐敗菌具有更顯著的抑菌效果，因此，芳樟醇是肉類保鮮中有效、天然的抑菌劑。

3 細(xì)菌生長曲線

在研究抑菌活性的基礎(chǔ)上，測定了大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和莓實假單胞菌的生長曲線。細(xì)菌在600 nm波長處對光的吸收較強，細(xì)菌添加量與其OD值呈正比關(guān)系，因此，可以采用OD600 nm值觀察細(xì)菌的生長情況，由此反映芳樟醇對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和莓實假單胞菌的抑制作用。由圖3可知，無菌水和甲醇處理的3 種細(xì)菌的生長軌跡呈現(xiàn)出經(jīng)典的“S”型模式，經(jīng)過0～4 h的適應(yīng)階段后，OD600 nm值顯著上升，隨后進入快速增殖的對數(shù)生長期，在14～16 h后達到穩(wěn)定期，表明細(xì)菌生長狀況良好，同時甲醇對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和莓實假單胞菌的生長影響與無菌水一致，不具有抑菌作用。

而1×MIC、2×MIC組細(xì)菌OD600 nm值在24 h內(nèi)幾乎無變化，數(shù)值和增長幅度明顯低于無菌水和甲醇，生長曲線呈現(xiàn)顯著差異，OD600 nm值基本處于低值波動，說明細(xì)菌生長受到抑制。結(jié)果表明，芳樟醇有效延緩甚至完全抑制了大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和莓實假單胞菌細(xì)胞的生長周期。這與先前的研究結(jié)論一致，說明芳樟醇對革蘭氏陰性菌和陽性菌具有廣泛的抑制作用。

4 電導(dǎo)率

電導(dǎo)率能夠反映溶液中的離子含量，研究表明，芳樟醇能夠作用于細(xì)胞膜使其膜結(jié)構(gòu)破裂，內(nèi)容物泄漏，導(dǎo)致菌體死亡，考察菌液中離子添加量對電導(dǎo)率的影響可以從側(cè)面探究芳樟醇對細(xì)胞膜的影響，進一步揭示芳樟醇的抑菌作用。如圖4所示，無菌水和甲醇處理的菌液電導(dǎo)率在處理過程中沒有顯著變化（P＞0.05），這表明菌液中的離子含量穩(wěn)定，水和甲醇的加入沒有破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)；而加入1×MIC和2×MIC芳樟醇后，大腸埃希氏菌的電導(dǎo)率立即迅速上升，金黃色葡萄球菌在6 h后、莓實假單胞菌在3 h后迅速上升，這是由于當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞膜被抑菌劑損害時，細(xì)胞膜的半透性喪失，胞內(nèi)電解質(zhì)大量流出，影響細(xì)菌生長。此外，2×MIC芳樟醇處理組比1×MIC芳樟醇處理組菌液的電導(dǎo)率變化更為明顯。

在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)外離子通過細(xì)胞膜的調(diào)控維持著一種動態(tài)平衡，使得細(xì)胞外環(huán)境的電導(dǎo)率保持相對穩(wěn)定。然而，當(dāng)受到抑菌物質(zhì)芳樟醇的影響時，大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和莓實假單胞菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，喪失了其保護與屏障功能。這導(dǎo)致原本存在于細(xì)胞內(nèi)的帶電離子（例如K＋、Na＋、Ca2＋、Mg2＋等）大量外泄到細(xì)胞膜外，進而引起細(xì)胞外電解質(zhì)添加量升高，最終使膜外環(huán)境的電導(dǎo)率顯著上升。本研究發(fā)現(xiàn)，芳樟醇能夠破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，提高細(xì)胞膜的通透性，進而對細(xì)菌的生長產(chǎn)生抑制作用。細(xì)胞膜的完整性對于維持細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)和能量的平衡至關(guān)重要，而這種平衡是細(xì)胞正常生理功能得以維持的基礎(chǔ)。結(jié)果表明，芳樟醇對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和莓實假單胞菌的細(xì)胞膜有明顯的破壞作用，并且隨著芳樟醇添加量的增加，抑制作用更明顯。

5 細(xì)菌表面形態(tài)

采用掃描電子顯微鏡對3 種細(xì)菌的表面形態(tài)進行觀察，進一步評價芳樟醇對生鮮肉類的致病菌和腐敗菌的形態(tài)變化。由圖5A1～C1可知，無菌水處理的大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和莓實假單胞菌的3 種細(xì)胞類型均展現(xiàn)了出明確的細(xì)胞輪廓，細(xì)胞整體構(gòu)造完整，細(xì)胞表面平整圓滑。其中大腸埃希氏菌和莓實假單胞菌呈正常的短桿狀，金黃色葡萄球菌呈飽滿的圓球狀。從圖5A2～C2可知，經(jīng)甲醇處理6 h后的大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和莓實假單胞菌，細(xì)胞無褶皺變形，形態(tài)較為完好，未發(fā)生明顯改變，形態(tài)與無菌水處理一致，說明甲醇對3種細(xì)胞形態(tài)無明顯影響。

芳樟醇處理后3 種菌的形態(tài)變化較為明顯。由圖5A3可知，添加1×MIC的芳樟醇作用6 h后，大腸埃希氏菌的細(xì)胞形態(tài)嚴(yán)重破壞，細(xì)胞膜邊界模糊，表面變得粗糙且不完整，細(xì)胞出現(xiàn)空洞干癟，出現(xiàn)明顯的細(xì)胞破裂，沒有觀察到形態(tài)正常的細(xì)胞。由圖5B3、C3可知，金黃色葡萄球菌和莓實假單胞菌的細(xì)胞破損黏合成團，細(xì)胞出現(xiàn)扭曲變形和堆疊黏連，大部分失去其原有形態(tài)。這是由于芳樟醇的疏水性使其聚集于細(xì)胞膜表面，破壞細(xì)菌膜結(jié)構(gòu)，從而抑制細(xì)菌生長，因此，芳樟醇能夠通過破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜，改變細(xì)胞形態(tài)，同時引起胞內(nèi)物質(zhì)外泄所致，引起菌液電導(dǎo)率的上升，電導(dǎo)率的實驗結(jié)果也證實了這一結(jié)論。掃描電子顯微鏡結(jié)果表明，芳樟醇可破壞鮮肉類的致病菌和腐敗菌的結(jié)構(gòu)形態(tài)，從而抑制其生長。

6 芳樟醇添加量對靜電紡絲纖維形態(tài)及直徑分布的影響

納米纖維膜的形貌受聚合物溶液添加量的影響很大，PCL添加量過低或過高均不利于獲得嵌合小分子客體均一的纖維。如圖6A所示，當(dāng)不添加芳樟醇時，PCL納米纖維表面光滑、無明顯串珠或結(jié)節(jié)，表明PCL分子鏈之間充分纏結(jié)，聚合物在電場中充分牽伸，是適宜負(fù)載小分子客體的聚合物纖維，纖維平均直徑為559.4 nm。如圖6B所示，當(dāng)添加芳樟醇添加量為10%時，纖維形態(tài)變細(xì)，纖維平均直徑為402.8 nm，表面無明顯串珠或結(jié)節(jié)現(xiàn)象，說明芳樟醇與PCL的共混改變了紡絲液的黏彈力、表面張力，芳樟醇與大分子在電場中共同牽伸，得到形態(tài)均一的纖維。如圖6C所示，當(dāng)芳樟醇添加量升高至20%時，纖維表面光滑，形態(tài)纖細(xì)均一，無明顯的微珠和缺陷，顯示出良好的纖維形態(tài)特征，纖維平均直徑進一步減小至300.7 nm。

隨著芳樟醇添加量增加，纖維直徑逐漸減小，可歸功于紡絲液黏度和表面張力的改變。如表2所示，芳樟醇添加量由0%增加至20%時，溶液黏度由340.32 Pa·s顯著降低至36.72 Pa·s（P＜0.05），這是由于小分子的芳樟醇通過嵌入烷基分子鏈，降低了聚合物的分子間作用力從而降低了溶液黏度；此外，溶液表面張力由31.69 mN/m逐漸降低至30.40 mN/m，可歸功于芳樟醇的兩親性導(dǎo)致紡絲液表面張力降低。因而在電場力不變的情況下，黏彈力和表面張力減弱，纖維受到的牽伸作用加強，形成直徑更小的納米纖維結(jié)構(gòu)。在PCL中加入芳樟醇導(dǎo)致PCL-LL纖維形貌的改變和直徑的減小，表明抑菌劑芳樟醇有效嵌入基材PCL纖維中，此前的研究也報道過直徑改變的現(xiàn)象。

當(dāng)芳樟醇用量為30%時，纖維形態(tài)如圖6D所示，纖維粗細(xì)不一致并伴有明顯的斷裂，纖維直徑差異大，在100～2 200 nm之間，無法測量平均直徑。這是由于高添加量的芳樟醇使得PCL添加量占比降低，在靜電紡絲過程中，聚合物分子鏈的纏結(jié)程度降低，導(dǎo)致紡絲液的黏彈性能減弱，此時溶液黏度顯著降低至23.79 Pa·s，表面張力進一步降低至9.15 mN/m。當(dāng)紡絲液噴射時，電場力顯著高于紡絲液內(nèi)部的黏彈力和表面張力，使得紡絲液更易被靜電場力拉伸、分裂，難以實現(xiàn)有效牽伸并嵌入小分子物質(zhì)。此外，當(dāng)紡絲液中溶劑添加量過高時，紡絲液在到達收集裝置時，溶劑未能充分揮發(fā)，大量殘留在纖維中。這使得射流在固化過程中因溶劑的殘留而發(fā)生斷裂和收縮，最終形成球狀結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致纖維呈現(xiàn)不連續(xù)的串珠狀。

結(jié)果表明，靜電紡絲方法成功獲得了抑菌納米纖維PCL/LL。在0%、10%、20%和30%的芳樟醇添加量中，較低芳樟醇添加量下得到纖細(xì)、牽伸均勻、無串珠的纖維，隨著芳樟醇添加量升高，纖維逐漸變粗，但芳樟醇添加量進一步升高至30%時，PCL纖維開始出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象。因此，使用PCL-20%LL紡絲液制備的納米纖維膜可最大程度負(fù)載芳樟醇，纖維形態(tài)穩(wěn)定一致，具有較好的均勻性和形態(tài)結(jié)構(gòu)可控性。

7 力學(xué)性能

采用拉伸法測定PCL和PCL-20%LL纖維膜的力學(xué)性能，結(jié)果如表3所示。在靜電紡絲過程中，紡絲射流在電場作用下拉伸變細(xì)，溶劑揮發(fā)后沉積在收集裝置上，纖維呈無序狀態(tài)，納米纖維膜的強力主要靠納米纖維之間的摩擦抱合力提供。初始PCL纖維膜的斷裂伸長率為43.74%，添加20%的芳樟醇后，納米纖維結(jié)構(gòu)蓬松，納米纖維之間的接觸點變少，摩擦抱合力減小，導(dǎo)致納米纖維膜的強力降低，納米纖維之間可滑移的距離增加，納米纖維膜的斷裂伸長率提高，達到55.80%。PCL纖維膜的韌性為643.69 kJ/m3，斷裂強度為3.35 MPa。添加芳樟醇后，芳樟醇嵌入PCL分子鏈間，活性的羥基與PCL形成氫鍵作用，削弱了PCL原有的分子間作用力，增加了鏈段活動性，使材料在受力時更易發(fā)生形變，因而PCL-20%LL纖維膜的韌性增大。同時芳樟醇均勻分散在共混溶液中，分散了原有的應(yīng)力集中中心，避免局部斷裂，因而PCL-20%LL纖維膜的斷裂強度增強。最終獲得負(fù)載芳樟醇的纖維膜厚度為0.039 mm，韌性為758.39 kJ/m3，斷裂強度為6.20 MPa。已報道一款用于牛肉包裝的聚乙烯醇/Ag@SiO2納米復(fù)合薄膜，其斷裂強度為0.91 MPa，表明PCL-20%LL纖維膜能夠用于食品包裝。后續(xù)可將抑菌纖維膜結(jié)合吸水性樹脂或紙纖維，彌補纖維膜厚度的不足，使其應(yīng)用于冷鮮肉的保鮮吸水襯墊。

8 水接觸角

水接觸角是指在固-液-氣三相接觸點處，水滴輪廓的氣-液界面切線與固體表面之間的夾角，即水滴輪廓與固體表面的切線和固-液界面的夾角。水接觸角大于90°表明材料具有疏水性，角度越大疏水性越強；反之，水接觸角小于90°則材料具有親水性。如表3所示，PCL和PCL-20%LL纖維膜的水接觸角分別為132.5°和133.3°，均為疏水纖維，且沒有顯著差異（P＞0.05）。結(jié)果表明，芳樟醇的添加不會顯著改變PCL纖維的水潤濕性，獲得的PCL-20%LL纖維依然具有良好的疏水性能。疏水材料由于固液接觸區(qū)較小，對水分的附著力較弱，可降低水分及親水物質(zhì)在材料表面的黏附。而負(fù)載百里香精油的玉米醇溶蛋白靜電紡絲纖維的水接觸角小于90°，有良好的親水性，在保鮮過程中有利于微生物附著在其表面。疏水材料通過降低對細(xì)胞的附著力，可抑制細(xì)胞生物膜的形成。因而，疏水的PCL-20%LL纖維膜可作為屏障功能和耐濕性的保鮮襯墊。

9 芳樟醇的釋放量

如圖7所示，0～1 d為芳樟醇的快速釋放階段，1 d時芳樟醇釋放量達39.0%；1～6 d為緩慢釋放階段，芳樟醇緩慢釋放，最終釋放量達到60.2%。芳樟醇隨機分布在PCL-20%LL靜電紡絲纖維中，分布在纖維表面的芳樟醇在初始的1d內(nèi)快速釋放，而纖維內(nèi)部的芳樟醇則在1～6 d內(nèi)逐漸釋放至纖維表面，測得的芳樟醇含量逐漸增加。研究表明，親脂化合物采用疏水材料負(fù)載可避免化合物的短期快速釋放。芳樟醇在納米纖維的負(fù)載呈現(xiàn)先快后慢的釋放模式，有利于延長芳樟醇的抑菌作用時間，因此，芳樟醇納米纖維膜在保鮮包裝中具有長效釋放性和應(yīng)用潛力。

10 纖維膜抑菌率及抑菌圈

抑菌率可作為評價樣品抑菌能力的參考指標(biāo)并被廣泛應(yīng)用。對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和莓實假單胞菌的抑菌率和抑菌圈直徑結(jié)果如表4所示，抑菌圈如圖8所示，PCL-20%LL纖維膜對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和莓實假單胞菌抑菌率分別為74.96%、76.34%和75.46%，抑菌圈直徑分別為12.30、10.76 mm和10.35 mm，展示了優(yōu)異的抑菌性能。在靜電紡絲的非熱牽伸過程中，不僅形成了均勻一致的纖維結(jié)構(gòu)，還保留了活性物質(zhì)芳樟醇的抑菌作用，是一種適宜負(fù)載活性成分的加工工藝。已報道了負(fù)載1%薰衣草精油（芳樟醇添加量為34.37%）的聚乙烯吡咯烷酮納米纖維膜包裝羊肉沫，10 d時抑制了羊肉沫中71.38%的菌落總數(shù)。因此，本研究提出的納米纖維膜通過保留芳樟醇本身對上述食源性致病菌和腐敗菌的抑菌活性，能夠在食品包裝中有效發(fā)揮抑菌作用，可作為保鮮襯墊延長食品貨架期，尤其在抑制革蘭氏陽性菌和生鮮肉類腐敗菌中有顯著抑制作用。

結(jié) 論

芳樟醇對生鮮肉類中的兩種致病菌（大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌）和一種腐敗菌（莓實假單胞菌）有顯著的抑菌作用，其中對金黃色葡萄球菌和莓實假單胞菌的抑制效果更為顯著。芳樟醇能破壞細(xì)胞膜的完整性，疏水作用使其聚集在細(xì)胞膜上，在細(xì)胞表面形成孔洞，使胞內(nèi)電解質(zhì)泄漏，導(dǎo)致細(xì)菌死亡。采用靜電紡絲將芳樟醇嵌合于PCL納米纖維，明確其抑菌作用和纖維結(jié)構(gòu)。在PCL基材的靜電紡絲液中，適宜的芳樟醇添加量為20%，制得的纖維平均直徑為300.7 nm，纖維膜斷裂強度為6.20 MPa，斷裂伸長率為55.80%，保留了芳樟醇的有效抑菌作用，對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌和莓實假單胞菌的抑菌率分別為74.96%、76.34%和75.46%。未來可深入探究抑菌墊中的芳樟醇在肉類貯藏期間的遷移過程，將芳樟醇抑菌墊應(yīng)用于肉類保鮮，延長鮮肉貨架期。

本文《 芳樟醇的抑菌作用及負(fù)載于納米纖維的性能 》來源于《食品科學(xué)》2025年46卷第19期18-27頁，作者： 黃婷，趙建偉，李大偉，陳龍，金征宇 。DOI: 10.7506/spkx1002-6630-20250314-113 。點擊下方 閱讀原文 即可查看文章相關(guān)信息。

實習(xí)編輯：安宏琳；責(zé)任編輯：張睿梅。點擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網(wǎng)