清華大學劉翔宇團隊最新PNAS

G蛋白偶聯受體（GPCRs）作為重要的藥物靶點，在藥物篩選中受到廣泛關注。基于結合作用的GPCR配體篩選方法通常需要構象穩定且純化的受體。然而，由于GPCRs固有的動態特性，獲取大量穩定狀態（尤其是具有未占據胞外配體結合位點并處于活性構象）的受體仍具挑戰性。

2025年11月4日，清華大學劉翔宇獨立通訊在PNAS（IF=9.4）在線發表題為“Extracellular nanobody screening using conformationally stable GPCR variants”的研究論文。該研究提出了一種穩定GPCRs于特定構象的通用策略。以M1毒蕈堿型乙酰膽堿受體（M1R）為模型，通過從頭設計融合蛋白，成功將M1R穩定在其活性構象，并將該策略應用于其他GPCRs，驗證了其普適性。

作者針對穩定后的活性態M1R及已報道的失活態M1R，篩選了合成的酵母展示納米抗體庫，鑒定出多個可特異性識別各構象的納米抗體。該方法不僅為穩定GPCRs于目標狀態提供了有效手段，也為開發更具選擇性的治療藥物、提升藥物發現效率與特異性提供了重要工具。

G蛋白偶聯受體（GPCRs）是跨膜信號轉導的核心介質，調控人類生理的幾乎所有方面。其在生理過程調控中的關鍵作用使GPCRs成為重要治療靶點。值得注意的是，約34%的美國食品藥品監督管理局（FDA）批準藥物通過調節GPCR活性發揮作用。盡管已有大量藥理學和結構學研究闡明了配體刺激或抑制這些受體的機制，針對GPCR的藥物研發仍面臨重大挑戰。其中尤為迫切的是構象選擇性和亞型選擇性配體的開發。GPCR的構象靈活性使得直接富集構象特異性配體變得復雜。GPCR通常存在于非活性態與活性態兩種主要狀態之間的構象譜中。顯著的構象變化發生在胞內區，特別是在跨膜螺旋6（TM6），而包含正構結合袋的胞外區動力學變化相對較小。這些細微的構象變化并不阻礙拮抗劑或激動劑的結合，而是調節它們對不同狀態受體的親和力。識別這些細微構象變化的配體對于發現功能特異性配體至關重要。基于結合的實驗篩選技術（如使用純化受體的DNA編碼文庫、酵母表面展示文庫和噬菌體展示文庫）為化學空間探索和構象選擇提供了前景廣闊的方法。此過程中的關鍵挑戰在于獲得構象穩定的純化受體，尤其是熱力學不穩定的活性態受體。對β2腎上腺素能受體（β2AR）、μ阿片受體（μOR）和毒蕈堿型乙酰膽堿受體2（M2R）等受體的分子動力學研究證明了活性構象的不穩定性。單分子研究表明，在無配體條件下或與拮抗劑/部分激動劑結合時，這些受體主要保持非活性態。即使存在完全激動劑，受體仍在活性態與非活性態之間波動。這種瞬態活性態對激動劑篩選構成顯著障礙。為解決此問題，研究中采用完全激動劑、G蛋白或G蛋白模擬物來穩定篩選過程中的活性態。雖然這些策略取得了一定成功，但也存在局限性：完全激動劑占據正構結合袋，導致無法篩選其他正構激動劑；且形成的受體- G蛋白/受體- G蛋白模擬物復合物通常不穩定，解離會破壞篩選過程。因此，亟需創新策略來設計能有效克服這些挑戰的構象穩定受體。

毒蕈堿型乙酰膽堿受體作為一類重要受體，在治療阿爾茨海默病、精神分裂癥和帕金森病等復雜神經精神疾病方面作為潛力靶點備受關注。盡管經過大量努力，基于膽堿能機制的藥物中僅有一種——沙諾美林聯合外周拮抗劑曲司氯銨（KarXT）——于2024年獲得FDA批準用于治療精神分裂癥。主要障礙在于膽堿能不良反應的發生，這通常源于對其他毒蕈堿型乙酰膽堿受體亞型的脫靶激活，導致大多數臨床試驗終止。因此過去十年間，學術界和工業界的研究重點一直集中于提升毒蕈堿型乙酰膽堿受體調節劑的亞型選擇性。

納米體-M1R復合物的結構洞察（圖片源自PNAS）

抗體為解決亞型選擇性配體開發挑戰提供了前景廣闊的方案，因其能夠結合受體表面的更廣泛表位，從而實現更具選擇性的結合。值得注意的是，該靶向策略的效力與抗體的藥理活性無關。通過與非選擇性配體偶聯，這些抗體可形成雙功能構建體，協同整合抗體的精準靶向特異性和配體的功能調節作用，從而為開發具有亞型選擇性的GPCR調節劑開辟新途徑。然而，針對毒蕈堿型乙酰膽堿受體家族的抗體調節劑研發仍處于探索不足的狀態。

作者此前報道了通過融合蛋白從頭設計鎖定M1R于非活性態的方法。本研究將設計策略拓展至穩定M1R的活性態。該方案成功實現了即使在無激動劑結合條件下仍能保持活性構象的GPCR。基于此設計，作者篩選了靶向M1R的系列納米抗體。結構學與藥理學分析表明，這些納米抗體通過作用于M1R胞外口袋，可發揮活性態選擇性納米抗體或非活性態選擇性納米抗體的功能。本研究共同驗證了利用構象鎖定GPCR篩選靶向GPCR胞外區納米抗體的概念可行性，并為M1R的藥物發現和機制研究提供了工具支持。

https://doi.org/10.1073/pnas.2508879122