清華大學(xué)劉翔宇團(tuán)隊最新PNAS

G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）作為重要的藥物靶點，在藥物篩選中受到廣泛關(guān)注。基于結(jié)合作用的GPCR配體篩選方法通常需要構(gòu)象穩(wěn)定且純化的受體。然而，由于GPCRs固有的動態(tài)特性，獲取大量穩(wěn)定狀態(tài)（尤其是具有未占據(jù)胞外配體結(jié)合位點并處于活性構(gòu)象）的受體仍具挑戰(zhàn)性。

2025年11月4日，清華大學(xué)劉翔宇獨立通訊在PNAS（IF=9.4）在線發(fā)表題為“Extracellular nanobody screening using conformationally stable GPCR variants”的研究論文。該研究提出了一種穩(wěn)定GPCRs于特定構(gòu)象的通用策略。以M1毒蕈堿型乙酰膽堿受體（M1R）為模型，通過從頭設(shè)計融合蛋白，成功將M1R穩(wěn)定在其活性構(gòu)象，并將該策略應(yīng)用于其他GPCRs，驗證了其普適性。

作者針對穩(wěn)定后的活性態(tài)M1R及已報道的失活態(tài)M1R，篩選了合成的酵母展示納米抗體庫，鑒定出多個可特異性識別各構(gòu)象的納米抗體。該方法不僅為穩(wěn)定GPCRs于目標(biāo)狀態(tài)提供了有效手段，也為開發(fā)更具選擇性的治療藥物、提升藥物發(fā)現(xiàn)效率與特異性提供了重要工具。

G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）是跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的核心介質(zhì)，調(diào)控人類生理的幾乎所有方面。其在生理過程調(diào)控中的關(guān)鍵作用使GPCRs成為重要治療靶點。值得注意的是，約34%的美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)藥物通過調(diào)節(jié)GPCR活性發(fā)揮作用。盡管已有大量藥理學(xué)和結(jié)構(gòu)學(xué)研究闡明了配體刺激或抑制這些受體的機(jī)制，針對GPCR的藥物研發(fā)仍面臨重大挑戰(zhàn)。其中尤為迫切的是構(gòu)象選擇性和亞型選擇性配體的開發(fā)。GPCR的構(gòu)象靈活性使得直接富集構(gòu)象特異性配體變得復(fù)雜。GPCR通常存在于非活性態(tài)與活性態(tài)兩種主要狀態(tài)之間的構(gòu)象譜中。顯著的構(gòu)象變化發(fā)生在胞內(nèi)區(qū)，特別是在跨膜螺旋6（TM6），而包含正構(gòu)結(jié)合袋的胞外區(qū)動力學(xué)變化相對較小。這些細(xì)微的構(gòu)象變化并不阻礙拮抗劑或激動劑的結(jié)合，而是調(diào)節(jié)它們對不同狀態(tài)受體的親和力。識別這些細(xì)微構(gòu)象變化的配體對于發(fā)現(xiàn)功能特異性配體至關(guān)重要。基于結(jié)合的實驗篩選技術(shù)（如使用純化受體的DNA編碼文庫、酵母表面展示文庫和噬菌體展示文庫）為化學(xué)空間探索和構(gòu)象選擇提供了前景廣闊的方法。此過程中的關(guān)鍵挑戰(zhàn)在于獲得構(gòu)象穩(wěn)定的純化受體，尤其是熱力學(xué)不穩(wěn)定的活性態(tài)受體。對β2腎上腺素能受體（β2AR）、μ阿片受體（μOR）和毒蕈堿型乙酰膽堿受體2（M2R）等受體的分子動力學(xué)研究證明了活性構(gòu)象的不穩(wěn)定性。單分子研究表明，在無配體條件下或與拮抗劑/部分激動劑結(jié)合時，這些受體主要保持非活性態(tài)。即使存在完全激動劑，受體仍在活性態(tài)與非活性態(tài)之間波動。這種瞬態(tài)活性態(tài)對激動劑篩選構(gòu)成顯著障礙。為解決此問題，研究中采用完全激動劑、G蛋白或G蛋白模擬物來穩(wěn)定篩選過程中的活性態(tài)。雖然這些策略取得了一定成功，但也存在局限性：完全激動劑占據(jù)正構(gòu)結(jié)合袋，導(dǎo)致無法篩選其他正構(gòu)激動劑；且形成的受體- G蛋白/受體- G蛋白模擬物復(fù)合物通常不穩(wěn)定，解離會破壞篩選過程。因此，亟需創(chuàng)新策略來設(shè)計能有效克服這些挑戰(zhàn)的構(gòu)象穩(wěn)定受體。

毒蕈堿型乙酰膽堿受體作為一類重要受體，在治療阿爾茨海默病、精神分裂癥和帕金森病等復(fù)雜神經(jīng)精神疾病方面作為潛力靶點備受關(guān)注。盡管經(jīng)過大量努力，基于膽堿能機(jī)制的藥物中僅有一種——沙諾美林聯(lián)合外周拮抗劑曲司氯銨（KarXT）——于2024年獲得FDA批準(zhǔn)用于治療精神分裂癥。主要障礙在于膽堿能不良反應(yīng)的發(fā)生，這通常源于對其他毒蕈堿型乙酰膽堿受體亞型的脫靶激活，導(dǎo)致大多數(shù)臨床試驗終止。因此過去十年間，學(xué)術(shù)界和工業(yè)界的研究重點一直集中于提升毒蕈堿型乙酰膽堿受體調(diào)節(jié)劑的亞型選擇性。

納米體-M1R復(fù)合物的結(jié)構(gòu)洞察（圖片源自PNAS）

抗體為解決亞型選擇性配體開發(fā)挑戰(zhàn)提供了前景廣闊的方案，因其能夠結(jié)合受體表面的更廣泛表位，從而實現(xiàn)更具選擇性的結(jié)合。值得注意的是，該靶向策略的效力與抗體的藥理活性無關(guān)。通過與非選擇性配體偶聯(lián)，這些抗體可形成雙功能構(gòu)建體，協(xié)同整合抗體的精準(zhǔn)靶向特異性和配體的功能調(diào)節(jié)作用，從而為開發(fā)具有亞型選擇性的GPCR調(diào)節(jié)劑開辟新途徑。然而，針對毒蕈堿型乙酰膽堿受體家族的抗體調(diào)節(jié)劑研發(fā)仍處于探索不足的狀態(tài)。

作者此前報道了通過融合蛋白從頭設(shè)計鎖定M1R于非活性態(tài)的方法。本研究將設(shè)計策略拓展至穩(wěn)定M1R的活性態(tài)。該方案成功實現(xiàn)了即使在無激動劑結(jié)合條件下仍能保持活性構(gòu)象的GPCR。基于此設(shè)計，作者篩選了靶向M1R的系列納米抗體。結(jié)構(gòu)學(xué)與藥理學(xué)分析表明，這些納米抗體通過作用于M1R胞外口袋，可發(fā)揮活性態(tài)選擇性納米抗體或非活性態(tài)選擇性納米抗體的功能。本研究共同驗證了利用構(gòu)象鎖定GPCR篩選靶向GPCR胞外區(qū)納米抗體的概念可行性，并為M1R的藥物發(fā)現(xiàn)和機(jī)制研究提供了工具支持。

https://doi.org/10.1073/pnas.2508879122