《中草藥》基于中藥超分子探討黃芪-莪術(shù)配伍增效抗肝癌的科學(xué)內(nèi)涵

原發(fā)性肝癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率與致死率均居前列的惡性腫瘤[1]。中醫(yī)認(rèn)為肝癌的核心病機(jī)為正氣虛損為本，痰濁凝滯、血瘀阻絡(luò)、癌毒內(nèi)蘊(yùn)為標(biāo)[2]。其病理基礎(chǔ)為正氣虧虛與血瘀形成互為因果的惡性循環(huán)[2]。故對(duì)此類患者的治療應(yīng)該以補(bǔ)氣益氣為主，輔以行血活血，以做到“祛瘀不傷正，扶正不留瘀”，因此臨床上益氣活血法被廣泛應(yīng)用于肝癌的治療[3-5]。

黃芪味甘，微溫，無(wú)毒，歸脾、肺二經(jīng)；是補(bǔ)氣類代表性中藥，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、利水消腫、托毒生肌等功效[6]。莪術(shù)味辛、苦，性溫，入肝經(jīng)，作為活血化瘀類中藥能大破氣中之血，故破血行氣為莪術(shù)之首要功效[7]。兩者配伍構(gòu)成益氣活血的經(jīng)典藥對(duì)。黃芪-莪術(shù)作為益氣活血的代表性藥對(duì)，最早見于《醫(yī)學(xué)衷中參西錄》中的理沖湯，具有補(bǔ)氣不壅中、攻破不傷正的特點(diǎn)[8]。竇永起教授指出，單用益氣藥雖能緩補(bǔ)正氣，但久用易致氣機(jī)壅滯，反不利于氣的運(yùn)行；而活血藥雖能化瘀行滯，但長(zhǎng)期使用易傷正氣；因此，氣血需協(xié)調(diào)并進(jìn)，益氣與活血藥物合用不僅可互補(bǔ)不足，更能協(xié)同發(fā)揮破瘀不傷正、行氣不留瘀的療效[9]。在臨床實(shí)踐中，唐德才教授探索將黃芪-莪術(shù)藥對(duì)用于腫瘤治療，并據(jù)此擬定“芪術(shù)抗癌方”，其中黃芪與莪術(shù)配比為2∶1。他認(rèn)為，莪術(shù)雖能破血行氣，但也易耗傷正氣；與黃芪合用則可增強(qiáng)破積消瘤之效，尤其適用于氣虛血瘀證型的腫瘤患者[10]。綜上，黃芪-莪術(shù)藥對(duì)在肝癌治療中療效確切，是抗肝癌中藥的重要組成。然而，其配伍協(xié)同的科學(xué)內(nèi)涵尚不明確，亟需深入研究與闡釋。

目前，關(guān)于藥對(duì)配伍的研究多聚焦于體內(nèi)外化學(xué)成分分析、藥動(dòng)學(xué)分析、藥理作用機(jī)制和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究等方面。黃芪-莪術(shù)配伍成分分析表明，黃芪中的皂苷類及黃酮類成分可顯著促進(jìn)莪術(shù)脂溶性成分（如莪術(shù)二酮、吉馬酮）的溶出（含量升高2～3倍），提示二者配伍具有促進(jìn)脂溶性成分溶出的作用[11]；同時(shí)也有研究表明，黃芪-莪術(shù)藥對(duì)可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶1（cyclin-dependent kinase 1，CDK1）、細(xì)胞周期蛋白B1（cyclin B1，CCNB1）等靶點(diǎn)及磷酸肌醇3-激酶-蛋白激酶B（phosphoinositide 3-kinase-protein kinase B，PI3K-Akt）、腫瘤蛋白 p53（tumor protein p53，p53）等信號(hào)通路，形成多成分-多靶點(diǎn)-多通路的抗肝癌協(xié)同作用網(wǎng)絡(luò)[12]。上述研究方法雖在一定程度上揭示了黃芪-莪術(shù)配伍在特定層面的配伍科學(xué)內(nèi)涵，但仍缺乏在物質(zhì)基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)及功能協(xié)同層面的系統(tǒng)認(rèn)識(shí)。因此需從更整體的角度出發(fā)，深入解析其配伍內(nèi)涵及多層面協(xié)同作用機(jī)制。

近年來(lái)，一種更具整體性和結(jié)構(gòu)性的中藥配伍研究思路逐漸受到關(guān)注。該思路基于“結(jié)構(gòu)中藥學(xué)”理論，旨在通過(guò)研究中藥煎煮過(guò)程中形成的中藥超分子（supramolecules of traditional Chinese medicine，STCM），闡釋中藥配伍的科學(xué)內(nèi)涵。已有研究發(fā)現(xiàn)在湯劑中存在由非共價(jià)鍵連接自組裝而成的STCM[13-17]。而結(jié)構(gòu)中藥學(xué)認(rèn)為結(jié)構(gòu)與藥效相關(guān)，中藥在煎煮過(guò)程中，不僅存在成分的單純?nèi)艹觯€存在成分間的相互作用，而成分間的相互作用會(huì)形成不同結(jié)構(gòu)的STCM，并且其與藥效相關(guān)，因此推測(cè)STCM是湯劑發(fā)揮療效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)之一[18]。STCM的提出不僅豐富了中藥配伍理論的研究層次，也為揭示藥對(duì)配伍協(xié)同機(jī)制提供了新的研究視角和方向。

本研究以黃芪-莪術(shù)藥對(duì)為對(duì)象，通過(guò)離心-透析法對(duì)STCM進(jìn)行分離；然后利用動(dòng)態(tài)光散射（dynamic light scattering，DLS）技術(shù)結(jié)合透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）對(duì)煎煮過(guò)程中形成的STCM進(jìn)行表征，利用光譜法對(duì)其形成機(jī)制進(jìn)行分析；隨后利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS）技術(shù)對(duì)STCM的成分進(jìn)行分析；最后對(duì)黃芪-莪術(shù)超分子（AstragaliRadix-CurcumaeRhizomasupramolecules of traditional Chinese medicine，AC-STCM）的體外抗肝癌活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1儀器與材料

1.1儀器

EX125DZH型電子天平，美國(guó)Ohaus公司；F-4700型熒光分光光度計(jì)、Hitachi HT-7800型透射電子顯微鏡，日本日立公司；Frontier FT-IR型紅外光譜儀，美國(guó)Perkin Elmer公司；Scientz-10N/A型冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；Milli-Q Direct型超純水機(jī)，美國(guó)Millipore公司；Zetasier Advance Series型粒度儀，英國(guó)Malvern公司；BB150型CO2細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱、Mul tiskan Sky High型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀、Ultimate 3000-Q-Exactive型超高效液相-四級(jí)桿-傅里葉變換質(zhì)譜儀，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；TDZ5-WS型多管架自動(dòng)平衡離心機(jī)，湖南平凡科技有限公司。

1.2材料

黃芪（批號(hào)23021327）、莪術(shù)（批號(hào)22040108）均購(gòu)自安徽協(xié)和成藥業(yè)飲片有限公司，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院趙東升教授鑒定，黃芪為豆科黃芪屬植物膜莢黃芪Astragalusmembranaceus (Fisch.) Bunge的干燥根，莪術(shù)為姜科姜黃屬植物蓬莪術(shù)Curcumaphaeocaulis Val.的干燥根莖。

光譜級(jí)溴化鉀（批號(hào)S30390）、透析袋（批號(hào)SP132594，截留相對(duì)分子質(zhì)量3 500）均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；人肝癌HepG2細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；DMEM高糖培養(yǎng)基（批號(hào)L100-500）、磷酸鹽緩沖液（PBS，批號(hào)L205-500）、胰蛋白酶（批號(hào)A300-100）均購(gòu)自浙江百迪生物科技有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，GC203002-100 mL）購(gòu)自武漢塞維爾生物科技有限公司；噻唑藍(lán)（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT，批號(hào)ST1537）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

2方法與結(jié)果

2.1STCM體系的發(fā)現(xiàn)與表征

2.1.1煎液（decoction，D）制備 稱取黃芪、莪術(shù)各60 g，分別裝入圓底燒瓶，加入600 mL超純水，浸泡30 min，沸騰后回流提取1 h，趁熱無(wú)紡紗布濾過(guò)，即得到黃芪單煎液（AstragaliRadix single decoction，A-D）和莪術(shù)單煎液（CurcumaeRhizoma single decoction，C-D），凍干保存。將上述A-D、C-D按照2∶1的比例，分別取各自單煎液的2/3和1/3液體混合均勻，即得黃芪-莪術(shù)物理混合液（Mix-D）。按照黃芪-莪術(shù)2∶1的比例，分別稱取黃芪40 g和莪術(shù)20 g，加入600 mL超純水，浸泡30 min，回流提取1 h，趁熱濾過(guò)，即得黃芪-莪術(shù)合煎液（AC-D）。所得樣品均通過(guò)冷凍干燥處理，得到其凍干粉末進(jìn)行保存和后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.1.2統(tǒng)計(jì)方法 使用Graphpad Prism 9.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與繪圖，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Dunnett?t檢驗(yàn)，測(cè)量值以
表示，P＜0.05表示具有顯著性差異。

2.1.3外觀顏色、丁達(dá)爾效應(yīng)觀察及凍干粉得率測(cè)定 AC-D、Mix-D、A-D、C-D均表現(xiàn)出一定的顏色差異，其中，AC-D呈淺黃色，較Mix-D顏色更淡，提示在煎煮過(guò)程中可能存在成分溶出的差異（圖1-a）。此外，4種煎煮液均呈現(xiàn)出明顯的丁達(dá)爾效應(yīng)，表明其中含有納米粒子，然而，其光路雖強(qiáng)但存在明顯散射現(xiàn)象，提示納米粒子分布可能不均勻（圖1-b）。將上述溶液凍干后得到的干粉，其顏色與原煎煮液顏色趨勢(shì)一致，且AC-D與Mix-D的凍干得率無(wú)顯著性差異，而Mix-D組的得率與A-D組和C-D組得率按比例相加所得結(jié)果基本一致（圖1-c和表1）。

為進(jìn)一步驗(yàn)證煎煮液中STCM的存在，對(duì)AC-D、Mix-D、A-D和C-D溶液的DLS結(jié)果及微觀形貌進(jìn)行對(duì)比分析。

2.1.4DLS技術(shù)分析各煎液的粒徑及ζ電位 將煎液樣品轉(zhuǎn)移至比色皿中，在粒度儀的“Size”模式下測(cè)定樣品的粒徑和多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI）；在粒度儀的“Zeta”模式下測(cè)定樣品ζ電位，平行3次，取平均值。結(jié)果顯示，AC-D粒徑較Mix-D粒徑?。▓D2-a和表1），ζ電位值表現(xiàn)出更優(yōu)越的穩(wěn)定性，且分散更均勻（圖2-b和表1）；值得注意的是，Mix-D的粒徑、ζ電位等理化參數(shù)與兩單煎液按比例混合所得的理論值接近，提示在物理混合過(guò)程中可能未發(fā)生成分自組裝。

2.1.5各煎液樣品的TEM觀察 將1滴待測(cè)的液體樣品置于碳涂層銅網(wǎng)格上，室溫下靜置2～3 min以便顆粒吸附，用1%醋酸雙氧鈾溶液作為染劑，將銅網(wǎng)格置于室溫下自然干燥。待完全干燥后，將樣品置于TEM下進(jìn)行觀察，并記錄其表面形貌及分布特征。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AC-D中存在不規(guī)則的類球形納米顆粒，Mix-D和A-D中存在大量不規(guī)絮狀聚集體，呈現(xiàn)出完全不同于AC-D的形貌；而C-D中也存在類球形納米顆粒（圖3），這提示C-D在形成納米粒子的過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。

以上結(jié)果表明，黃芪-莪術(shù)的合煎過(guò)程中并不是單純的成分溶出過(guò)程，其中也存在成分間的相互作用，最終形成了一種混懸的STCM聚集體。隨后，將上述4種煎液，以3 000 r/min（1 260×g）的轉(zhuǎn)速離心30 min，將上清液使用透析袋（截留相對(duì)分子質(zhì)量3 500）進(jìn)行透析處理，所得透析內(nèi)液即為STCM[19-21]。

2.2STCM體系的表征

2.2.1STCM的提取 將黃芪、莪術(shù)按照2∶1的比例，各稱取40 g和20 g，加入600 mL超純水，浸泡30 min，回流提取1 h，趁熱濾過(guò)，得AC-D，將其以3 000 r/min（1 260×g）的轉(zhuǎn)速離心30 min，將上清液使用透析袋（截留相對(duì)分子質(zhì)量3 500）進(jìn)行透析處理，透析內(nèi)液即為黃芪-莪術(shù)超分子（AC-STCM）。同理可得黃芪-莪術(shù)混合超分子（Mix-STCM），各樣品均凍干保存（操作同“2.1.1”項(xiàng)）。將Mix-STCM液體加熱至沸騰后回流1 h，所得產(chǎn)物即為Mix-hot組分。

2.2.2STCM外觀顏色和丁達(dá)爾效應(yīng)表征及凍干粉得率測(cè)定 經(jīng)離心-透析分離后，對(duì)獲得的4組STCM（AC-STCM、Mix-STCM、A-STCM、C-STCM）進(jìn)行系統(tǒng)表征。結(jié)果顯示，4組溶液顏色較對(duì)應(yīng)的煎液組（AC-D、Mix-D、A-D、C-D）均有所變淺，其中AC-STCM溶液呈淺黃色，較Mix-STCM顏色淺（圖4-a、5-a）；4組STCM溶液均呈現(xiàn)出明顯的丁達(dá)爾效應(yīng)，表明體系中有納米粒子；但相比于煎液組，光散射程度有所減弱，提示這些樣品中的粒徑分布更加均一，這可能與離心過(guò)程中對(duì)大顆粒的去除有關(guān)（圖4-b、5-b）；進(jìn)一步將4組STCM經(jīng)過(guò)凍干處理后，對(duì)凍干粉理化性質(zhì)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)凍干粉的色澤趨勢(shì)與溶液狀態(tài)保持高度一致（圖4-c、5-c），并且其得率趨勢(shì)與煎液組結(jié)果相符（表2）；然而，所有STCM得率均顯著低于煎液組（表1、2），原因可能是在離心過(guò)程中除去了不溶性成分以及某些較大聚集體。

2.2.3DLS技術(shù)分析各STCM的粒徑及ζ電位 進(jìn)一步對(duì)STCM的DLS結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。如圖6-a和表2所示，4組STCM的粒徑并無(wú)顯著性差異，可能由于各組樣品均經(jīng)過(guò)相同的分離過(guò)程，導(dǎo)致其粒徑集中于相近的范圍內(nèi)。然而，在電位測(cè)試中，AC-STCM與其余3組相比表現(xiàn)出顯著差異，提示其表面電荷不同（圖6-b和表2）。此外，各組的ζ電位和PDI趨勢(shì)與煎液組保持一致，其中AC-STCM的PDI值最低，表明其粒徑分布仍最為均勻（表3）。綜合以上結(jié)果可見，盡管各組STCM的粒徑大小相似，但其結(jié)構(gòu)特征存在差異。尤其是合煎過(guò)程中生成的AC-STCM，其粒子表面電荷及分布均一性均顯示出獨(dú)特特征，提示不同配伍方式可導(dǎo)致形成具有差異性結(jié)構(gòu)特征的STCM聚集體。

2.2.4各STCM樣品的TEM觀察 進(jìn)一步通過(guò)TEM觀察4組STCM形貌，發(fā)現(xiàn)AC-STCM主要以300 nm左右的不規(guī)則球形存在，邊界清晰；而Mix-STCM則更多以A-STCM為主，以不規(guī)則、松散聚集的絮狀為主，形態(tài)差異明顯，這也說(shuō)明在混合過(guò)程中未進(jìn)一步組裝成新的STCM（圖7）。該結(jié)果與DLS分析結(jié)果高度一致，進(jìn)一步證實(shí)合煎對(duì)STCM結(jié)構(gòu)特征的調(diào)控作用。AC-STCM通過(guò)合煎誘導(dǎo)形成的有序STCM結(jié)構(gòu)可能為其穩(wěn)定性提升及藥效增強(qiáng)提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

2.2.5各STCM樣品的熒光光譜法（fluorescence spectroscopy，F(xiàn)S）分析 為了進(jìn)一步分析合煎是否發(fā)生自組裝，產(chǎn)生新的STCM，將待測(cè)液體樣品置于樣品池，打開儀器預(yù)熱30 min，激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)定為340 nm，在波長(zhǎng)360～600 nm進(jìn)行掃描，結(jié)果見圖8。在相同激發(fā)波長(zhǎng)下，各組樣品的發(fā)射強(qiáng)度存在一定差異，其中AC-STCM與Mix-STCM之間的發(fā)射強(qiáng)度存在差異，提示物理混合過(guò)程中可能未發(fā)生有效自組裝，從而導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)存在不同。

2.2.6各STCM樣品的紅外光譜法（infrared spectroscopy，IR）分析 將“2.2.1”項(xiàng)中得到的凍干粉末用于該實(shí)驗(yàn)。取各樣品凍干粉末與光譜級(jí)溴化鉀（KBr）混合研磨（分析NaOH干擾氫鍵時(shí)，樣品凍干粉與KBr和NaOH混合研磨），進(jìn)行壓片后置于紅外光譜儀上扣除空氣背景后，設(shè)置掃描范圍4 000～400 cm?1，進(jìn)行掃描，結(jié)果見圖9。AC-STCM在1 042 cm?1處的C-O伸縮振動(dòng)出現(xiàn)明顯紅移，結(jié)合O-H的伸縮振動(dòng)從3 377 cm?1向3 351 cm?1紅移了26 cm?1，提示C-O···H型氫鍵形成，從而佐證在自組裝過(guò)程中各種成分間存在氫鍵連接，這可能是AC-STCM結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的主要非共價(jià)作用之一。此外，C-H的伸縮振動(dòng)由2 930 cm?1向高波數(shù)移動(dòng)至2 938 cm?1，表明可能存在疏水相互作用，使分子間堆積更為緊密，從而引起C-H鍵電子云分布的改變。苯環(huán)骨架振動(dòng)由1 623 cm?1向低波數(shù)移動(dòng)至1 616 cm?1，紅移7 cm?1，推測(cè)可能由于π-π堆積作用增強(qiáng)，使分子排列更緊湊，電子云密度降低，從而導(dǎo)致振動(dòng)頻率下降。與此同時(shí)，根據(jù)AC-STCM的紅外特征吸收峰初步推測(cè)，其主要組成成分可能為黃芪多糖，由于其結(jié)構(gòu)中存在大量羥基，這進(jìn)一步支持氫鍵在合煎過(guò)程中參與了自組裝過(guò)程并形成了特定的STCM結(jié)構(gòu)[22-24]。綜上，AC-STCM在紅外特征吸收峰的整體變化揭示了氫鍵、疏水作用與π-π堆積等非共價(jià)相互作用在其自組裝過(guò)程中的協(xié)同貢獻(xiàn)。

2.2.7紅外光譜驗(yàn)證AC-STCM樣品中氫鍵破壞情況 考慮到已有文獻(xiàn)證實(shí)黃芪多糖可通過(guò)氫鍵與黃酮類化合物形成穩(wěn)定的STCM[24]。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)中AC-STCM以黃芪多糖為主要成分的猜想，推測(cè)氫鍵在其自組裝過(guò)程中可能起到主導(dǎo)作用。為驗(yàn)證該假設(shè)，通過(guò)添加NaOH破壞體系中的氫鍵，并采用紅外光譜對(duì)處理前后AC-STCM的變化進(jìn)行分析，從而探究氫鍵對(duì)自組裝形成的影響[25-26]。結(jié)果（圖10）顯示，AC-NaOH樣品在3 000～3 700 cm?1的O-H伸縮振動(dòng)吸收峰顯著減弱甚至消失，提示NaOH的堿性環(huán)境有效破壞了原體系中廣泛存在的氫鍵結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步印證了AC-STCM很大程度上依賴于氫鍵的穩(wěn)定維系。

2.2.8熒光光譜法驗(yàn)證STCM樣品的熱驅(qū)動(dòng)現(xiàn)象 通過(guò)TEM結(jié)果以及熒光光譜分析推測(cè)物理混合過(guò)程中未繼續(xù)進(jìn)行有效的自組裝，所以隨后探究熱力學(xué)是否對(duì)STCM自組裝過(guò)程有驅(qū)動(dòng)作用。對(duì)Mix-STCM樣品進(jìn)行了加熱處理，并監(jiān)測(cè)其熒光發(fā)射強(qiáng)度變化。結(jié)果顯示，加熱處理后，Mix-STCM的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)出向AC-STCM靠近的趨勢(shì)，提示其自組裝行為受熱力學(xué)調(diào)控。然而，盡管Mix-STCM加熱后有向AC-STCM靠近的趨勢(shì)，但Mix-STCM在加熱后其熒光特性仍無(wú)法與AC-STCM重合，表明其結(jié)構(gòu)特征未能實(shí)現(xiàn)有效重構(gòu)（圖11）。這可能是由于STCM的生成雖以熱力學(xué)驅(qū)動(dòng)為主，但煎煮過(guò)程中關(guān)鍵成分的協(xié)同溶出行為及其在體系中的空間分布關(guān)系亦對(duì)其結(jié)構(gòu)構(gòu)建產(chǎn)生顯著影響。

2.2.9STCM穩(wěn)定性評(píng)價(jià) 對(duì)STCM在7 d內(nèi)的粒徑與ζ電位進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)粒徑隨時(shí)間均呈現(xiàn)不同程度的增加，而ζ電位變化不明顯（圖12-a、b）。這一現(xiàn)象可能源于粒徑測(cè)試本質(zhì)上反映的是“水合粒徑”，隨著時(shí)間推移，STCM表面暴露的功能基團(tuán)逐漸通過(guò)非共價(jià)作用發(fā)生相互連接，從而在粒徑檢測(cè)中表現(xiàn)為表觀粒徑的增加。與此同時(shí)，電位未出現(xiàn)顯著波動(dòng)，提示體系整體的表面電荷密度保持穩(wěn)定，這仍能在一定程度上阻止劇烈聚集。值得注意的是，相較于Mix-STCM，AC-STCM的粒徑波動(dòng)更大，可能是由于合煎過(guò)程中更多親水與疏水活性成分溶出并參與自組裝，使得體系結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜和動(dòng)態(tài)，從而導(dǎo)致其在儲(chǔ)存過(guò)程中粒徑變化更為顯著。

綜上所述，成功從黃芪-莪術(shù)合煎液中分離獲得了STCM，并證實(shí)其在煎煮過(guò)程中可通過(guò)氫鍵和π-π堆積作用實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的自組裝結(jié)構(gòu)。該過(guò)程可能主要受熱力學(xué)驅(qū)動(dòng)，但其形成亦與體系中的具體成分密切相關(guān)。因此，進(jìn)一步分析STCM的化學(xué)組成，有助于揭示其形成的物質(zhì)基礎(chǔ)與形成機(jī)制。

2.3AC-STCM和Mix-STCM成分分析

采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS）對(duì)AC-STCM和Mix-STCM進(jìn)行成分分析。將樣品于超純水中超聲溶解，使用Thermo Ultimate 3000-Q-Exactive Focus對(duì)樣品進(jìn)行分析，樣品在Hypersi Gold（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）色譜柱上進(jìn)行分離，柱溫為40 ℃，流動(dòng)相使用0.1%甲酸水溶液（A）、0.1%甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脫：0～2.0 min，5% A；2.0～42.0 min，5%～95% A；42.0～47.0 min，95% A；47.0～47.1 min，95%～5% A；47.1～50.0 min，5% A；進(jìn)樣量5 μL。質(zhì)譜條件：ESI電噴霧離子源，正離子噴霧電壓3.5 kV，負(fù)離子噴霧電壓?3.2 kV，毛細(xì)管溫度320 ℃，二級(jí)碰撞能量20、40、60 eV，檢測(cè)模式為全MS-ddMS2，分別掃描正離子模式和負(fù)離子模式，掃描范圍為m/z 100～1 500，MS1分辨率設(shè)置為70 000，MS2分辨率設(shè)置為17 500。

對(duì)AC-STCM和Mix-STCM進(jìn)行成分對(duì)比分析，結(jié)果（圖13-a～b和圖14）顯示，AC-STCM的主要成分包含毛蕊異黃酮苷、芒柄花苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、大豆皂苷和雙去甲氧基姜黃素等（表4）。與Mix-STCM進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)，AC-STCM中上述成分的含量均呈現(xiàn)不同程度的升高（圖15）。由于黃芪多糖的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，缺乏有效電離片段，在LC-MS中難以檢測(cè)，因此其未出現(xiàn)在上述譜圖中。然而，結(jié)合紅外光譜分析結(jié)果，AC-STCM中仍可觀察到典型的黃芪多糖特征吸收峰（圖9），間接證實(shí)其作為自組裝成分的存在。

值得注意的是，AC-STCM其穩(wěn)定的STCM結(jié)構(gòu)可能通過(guò)空間框架與分子間相互作用，促進(jìn)活性成分的富集。即AC-STCM的構(gòu)建過(guò)程或與成分的穩(wěn)定富集存在相互促進(jìn)關(guān)系。以上結(jié)果表明，在配伍合煎的過(guò)程形成的自組裝STCM起到了成分富集的作用，這可能是黃芪-莪術(shù)配伍發(fā)揮協(xié)同增效作用的重要機(jī)制之一。

2.4體外抗肝癌活性研究

2.4.1細(xì)胞毒性測(cè)試 本研究以HepG2肝癌細(xì)胞系為模型，為驗(yàn)證AC-STCM是否為黃芪-莪術(shù)藥對(duì)協(xié)同增效的關(guān)鍵物質(zhì)基礎(chǔ)，開展了細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞均勻接種到96孔板中（5 000個(gè)細(xì)胞/孔），培養(yǎng)24 h后分別給予不同質(zhì)量濃度（0、1、5、10、15、20 mg/mL）的AC-D、Mix-D、AC-STCM、Mix-STCM，對(duì)照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)置調(diào)零孔（不接種細(xì)胞），處理24 h，處理后每孔加入MTT溶液（終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL），37℃孵育4 h；去上清，加入100 μL DMSO終止孵育，使用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處的吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝(A給藥－A調(diào)零)/(A對(duì)照－A調(diào)零)

結(jié)果（表5）顯示，無(wú)論是STCM組還是煎液組，配伍合煎液的抗腫瘤效果均優(yōu)于對(duì)應(yīng)的物理混合組，提示“藥對(duì)合煎配伍”在提升藥效方面具有重要作用；與AC-D相比，AC-STCM表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗腫瘤活性。

2.4.2細(xì)胞結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn) 將HepG2細(xì)胞接種于6孔板中，使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，至細(xì)胞增殖到融合度達(dá)到90%時(shí)分別加入0、5、10、15、20、25mg/mL的含藥培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄去含藥培基，多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色。結(jié)晶紫染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖16）顯示，AC-STCM對(duì)HepG2細(xì)胞具有明顯的抑制作用，且呈質(zhì)量濃度相關(guān)性。

2.4.3細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn) 將HepG2細(xì)胞接種于6孔板中，使用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，至細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)，使用200 μL槍頭劃痕，用PBS清洗后替換成含0、0.5、1.0 mg/mL的含藥培養(yǎng)基，拍攝0、24、48、72 h時(shí)的圖像。獲得的圖像使用Image J軟件進(jìn)行劃痕面積統(tǒng)計(jì)并計(jì)算劃痕遷移率。

細(xì)胞遷移率＝(S0－SN)/S0

S0為0 h時(shí)各組劃痕面積，SN為N h時(shí)各組劃痕面積（N＝24、48、72）

將HepG2細(xì)胞分別接種于6孔板中（每孔500個(gè)），待細(xì)胞貼壁后，分別加入0、0.5、1.0mg/mL的含藥培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)14 d，期間每3天更換含藥培養(yǎng)基。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，棄去培養(yǎng)基，4%多聚甲醛固定后結(jié)晶紫染色，使用相機(jī)拍攝結(jié)晶紫染色結(jié)果?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明，AC-STCM可有效抑制HepG2細(xì)胞的增殖與遷移能力（圖17-a、b和表6）。

綜上所述，黃芪-莪術(shù)配伍具有明顯的增效抗肝癌作用，且AC-STCM極可能是AC-D發(fā)揮抗肝癌活性的關(guān)鍵物質(zhì)基礎(chǔ)。這一發(fā)現(xiàn)為中藥配伍的物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了新的思路和證據(jù)。

3討論

隨著STCM化學(xué)的不斷發(fā)展，其與中醫(yī)藥的交叉融合日益深入。已有研究表明在多種中藥復(fù)方、藥對(duì)及單味藥煎煮液中存在由非共價(jià)鍵連接自組裝形成的STCM[27-30]。當(dāng)前關(guān)于藥對(duì)配伍增效機(jī)制的研究主要集中于成分分析與作用機(jī)制探索，而STCM的提出為從整體層面解析中藥配伍規(guī)律提供了全新視角[27-30]。

中醫(yī)認(rèn)為肝癌的核心病機(jī)為氣虛血瘀，黃芪-莪術(shù)作為“益氣活血”經(jīng)典藥對(duì)，常用于肝癌的治療。本研究基于STCM化學(xué)理論，聚焦于黃芪-莪術(shù)合煎過(guò)程中成分間的相互作用是否能夠形成不同于物理混合產(chǎn)生的自組裝STCM。通過(guò)DLS與TEM橫向?qū)Ρ華C-STCM和Mix-STCM的差異，AC-STCM粒徑更小、分布更均勻且更加穩(wěn)定。進(jìn)一步通過(guò)FS和IR對(duì)STCM的形成機(jī)制進(jìn)行分析，結(jié)果提示，黃芪-莪術(shù)在煎煮過(guò)程中會(huì)在熱力學(xué)的驅(qū)動(dòng)下通過(guò)氫鍵等非共價(jià)鍵自組裝成不同于物理混合組的類球形STCM。已有研究表明黃芪-莪術(shù)合煎可以促進(jìn)成分溶出，為探究STCM在其中的作用，本研究利用LC-MS對(duì)AC-STCM和Mix-STCM的化學(xué)成分進(jìn)行比較分析，結(jié)果顯示AC-STCM中若干關(guān)鍵成分含量高于物理混合體系，該結(jié)果提示STCM的形成過(guò)程可能伴隨成分溶出的富集，這一協(xié)同效應(yīng)或?yàn)榕湮樵鲂У闹匾镔|(zhì)基礎(chǔ)。進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)表明，黃芪-莪術(shù)合煎體系對(duì)HepG2細(xì)胞具有更顯著的抑制作用，驗(yàn)證了STCM的形成與抗腫瘤活性提升之間存在密切關(guān)聯(lián)。此外黃芪中主要成分比如毛蕊異黃酮、毛蕊異黃酮苷、芒柄花素、芒柄花苷等黃酮類成分由于結(jié)構(gòu)中存在C6-C3-C6的苯環(huán)骨架，平面芳香結(jié)構(gòu)利于π-π堆積，并且毛蕊異黃酮苷和芒柄花苷具有糖基，提供了氫鍵結(jié)合位點(diǎn)，所以這些黃酮及其苷類成分具有自組裝的潛力；莪術(shù)的主要成分比如姜黃素和雙去甲氧基姜黃素?fù)碛虚L(zhǎng)鏈共軛雙鍵結(jié)構(gòu)和2個(gè)芳香環(huán)，其β-二酮結(jié)構(gòu)利于氫鍵和金屬配位，同時(shí)能形成π-π堆積和氫鍵進(jìn)行自組裝。綜上所述，根據(jù)成分的結(jié)構(gòu)特征，黃芪與莪術(shù)的成分具備自組裝形成STCM的潛力，所以后續(xù)研究中將會(huì)從成分入手，進(jìn)一步闡釋黃芪-莪術(shù)藥對(duì)在成分層面的配伍科學(xué)內(nèi)涵。

本研究系統(tǒng)闡釋了“配伍合煎-超分子自組裝-協(xié)同增效”三者之間的內(nèi)在關(guān)聯(lián)機(jī)制，不僅為黃芪-莪術(shù)藥對(duì)在抗肝癌中的配伍規(guī)律提供了理論支持，也為中藥復(fù)方“整體觀”的研究提供了STCM化學(xué)視角下的創(chuàng)新方法，為中藥藥對(duì)配伍增效的物質(zhì)基礎(chǔ)與科學(xué)內(nèi)涵研究提供理論與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。但是不可否認(rèn)本研究存在以下局限性，由于中藥湯劑中STCM的復(fù)雜性及動(dòng)態(tài)變化特征，當(dāng)前研究尚未能解析其精細(xì)結(jié)構(gòu)，也未能明確活性成分在自組裝過(guò)程中是否存在特定的結(jié)構(gòu)偏好性；此外，盡管通過(guò)LC-MS分析推測(cè)STCM的形成伴隨活性成分的富集，但尚未深入揭示該富集效應(yīng)發(fā)生的具體機(jī)制；最后，本實(shí)驗(yàn)的藥效驗(yàn)證仍局限于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)并且并不能說(shuō)明兩者配伍“破瘀不傷正、行氣不留瘀”的科學(xué)內(nèi)涵，下一步將在動(dòng)物模型等體內(nèi)環(huán)境中開展更全面、精確的藥效評(píng)價(jià)研究，以進(jìn)一步確認(rèn)其生物學(xué)效應(yīng)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

參考文獻(xiàn)（略）

來(lái) 源：劉若雨，王祖馳，劉名玉，趙春芹，張 振，李 肖．基于中藥超分子探討黃芪-莪術(shù)配伍增效抗肝癌的科學(xué)內(nèi)涵 [J]. 中草藥, 2026, 57(3):859-870.

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