CTM丨范小英團隊開發高通量單細胞表觀多組學測序技術SpliCOOL-seq

DNA 甲基化與染色質可及性是調控細胞特異性基因表達的關鍵表觀遺傳機制。 DNA 甲基化主要發生在 CpG 二核苷酸上，通過阻礙轉錄因子結合或招募甲基結合蛋白來介導轉錄沉默。染色質可及性則反映了核小體定位與調控元件的活性，決定了轉錄機制及增強子 - 啟動子相互作用對 DNA 的空間可及性。這兩種表觀遺傳模式的相互作用對維持細胞穩態至關重要，例如在原始生殖細胞中，全基因組 DNA 甲基化擦除與染色質重塑同步發生，以重置細胞多能性。在腫瘤中，致癌基因啟動子的低甲基化與抑癌基因的高甲基化常伴隨調控區域的染色質壓縮【1–4】。

同時檢測全基因組 DNA 甲基化與染色質可及性并進行整合分析，能夠全面揭示生理與疾病狀態下表觀遺傳的協同調控機制，為生物標志物發現與治療干預提供新機遇。目前已有多種單細胞多組學技術（如 scCOOL -seq 、 scNMT -seq 等）能夠實現同一細胞內多種表觀遺傳信息的同步測量。然而，這些技術均依賴于單細胞裂解液，導致細胞通量嚴重受限，且成本高、耗時久【5,6】。因此，發展能夠同步檢測全基因組 DNA 甲基化與染色質可及性的高通量單細胞測序技術仍面臨挑戰。

近日 ，廣州國家實驗室的范小英團隊在Clinical and Translational Medicine雜志上發表了題為High-throughput single-cell DNA methylation and chromatin accessibility co-profiling withSpliCOOL-seq的文章。在這項研究中，研究團隊開發了一種名為SpliCOOL-seq的多組學測序技術（圖1），能夠同時對數千個細胞的全基因組DNA甲基化和染色質可及性進行分析。通過整合原位 GpC 甲基化、通用 Tn5 標簽化以及組合條形碼技術， SpliCOOL -seq 實現了更高的靈敏度和可擴展性。借助這項技術，研究團隊深入探究了原發性肺腺癌，能夠識別腫瘤病灶內的腫瘤亞克隆，并發現與患者生存相關的新型 DNA 甲基化生物標志物（如 FAM124B 、 SFN 、 OR7E47P ）。此外，還證明了腫瘤亞克隆中存在加速的表觀遺傳衰老和有絲分裂活動，為腫瘤發生提供了新的見解。

圖 1. SpliCOOL -seq 流程

首先，為評估 SpliCOOL -seq 解析細胞類型特異性 DNA 甲基化與染色質可及性的能力，研究團隊將其應用于 A549 、 H460 和 SK-MES 三株肺癌細胞系。分析顯示，所有細胞在轉錄起始位點（ TSS ）均呈現 WCG 甲基化水平下降，而基因體區域甲基化最高。不同細胞類型間全基因組甲基化水平與染色質可及性并不簡單對應，揭示了表觀共調控的復雜性。基于 WCG 和 GCH 甲基化數據均可清晰區分三種細胞類型；與 scATAC -seq 數據的對比驗證了 SpliCOOL -seq 所檢測的核小體缺失區域（ NDR ）的真實性，且兩者鑒定的細胞類型特異性可及區域及富集轉錄因子基序高度一致。此外， SpliCOOL -seq 亦能準確捕獲不同癌細胞的拷貝數變異（ CNV ）。綜上，該技術實現了在同一單細胞內對 DNA 甲基化與染色質可及性的高靈敏度、高精度整合分析。

隨后，研究團隊利用 SpliCOOL -seq 成功解析了肺癌細胞的表觀遺傳異質性，并取得系列重要發現（圖2）：

1. 揭示DNMT抑制劑作用新模式：研究發現，兩種常用的 DNA 去甲基化藥物（ 5- 氮雜胞苷和地西他濱）雖都能引起全局 DNA 去甲基化，但其作用模式存在顯著差異，靶向區域各有偏好，這為臨床合理化用藥提供了新見解。

2. 發現肺腺癌腫瘤內亞克隆：在對臨床肺腺癌組織的分析中， SpliCOOL -seq 不僅區分了癌旁與癌組織細胞，更在腫瘤內部鑒定出具有不同拷貝數變異和表觀遺傳特征的兩個腫瘤亞克隆（ PC1 和 PC2 ），以及一組已出現基因組異常但表觀遺傳狀態仍接近正常的“癌旁癌變細胞”（ AC ），為理解腫瘤早期演化提供了新視角。

3. 鑒定新型預后相關甲基化標志物：通過整合分析，團隊發現了一批與肺腺癌患者生存顯著相關的 DNA 甲基化標志基因，如 FAM124B 、 SFN （ Stratifin ）、 OR7E47P 等。其中，團隊通過 CRISPR 基因敲除和功能實驗驗證了 SFN 基因在促進肺癌細胞增殖和遷移中的關鍵作用。

揭示癌細胞表觀遺傳“加速衰老” ：研究首次在單細胞層面發現，腫瘤細胞表現出明顯的表觀遺傳年齡加速和細胞分裂速率加快，且與正常細胞共享部分衰老相關的甲基化信號，提示衰老與腫瘤發生存在共同的表觀遺傳基礎。

圖 2. SpliCOOL -seq 解析肺癌細胞表觀異質性及表觀衰老

綜上所述， 本研究提供了一種高通量單細胞測序技術，能夠在單個細胞內同時對全基因組 DNA 甲基化和染色質可及性進行平行分析。這種集成方法在闡明不同細胞狀態下的基因調控相互作用方面具有巨大潛力。 SpliCOOL -seq 能夠實現高分辨率、多模態的單細胞表觀遺傳學分析，為發現癌癥生物標志物提供了一個強大的平臺。其應用揭示了新的治療靶點和早期診斷標志物，突顯了其在精準腫瘤學中的潛力。

原文鏈接：http://dx.doi.org/10.1002/ctm2.70584

制版人：十一

參考文獻

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