半透膜膠囊，最新Science！

生物系統(tǒng)的內在復雜性與異質性，使得解析生命基本原理日益依賴于能夠提供廉價、高精度單細胞與單分子分析的工具與方法。盡管已有多種平臺技術可用于單細胞基因組、轉錄組和表觀基因組分析，但現(xiàn)有方法存在顯著局限。例如，基于液滴微流控的高通量方法通常局限于“一鍋法”反應，無法在過程中更換試劑；而微孔板雖靈活，卻通量有限、體積大、操作繁瑣。理想方案需兼具液滴微流控的通量優(yōu)勢與微孔板平臺的靈活性。

近日，立陶宛維爾紐斯大學Linas Mazutis教授課題組提出了一種基于半透膜膠囊的通用型高通量單細胞組學技術。該技術利用半透膜膠囊，可靈活應用于多種高通量核酸分析，包括單細胞基因組與mRNA測序，以及基于特定核酸標記、通過熒光激活細胞分選技術分離單個轉錄組。SPCs具有良好的生物相容性，支持單細胞的長期培養(yǎng)與克隆擴增，從而克服了液滴微流控平臺的一個根本性限制。總體而言，SPCs為基于多步生化反應的、易于使用且可擴展的單細胞組學應用提供了一個可定制的通用工具。相關論文以“High-throughput single cell omics using semipermeable capsules”為題，發(fā)表在

Science

半透膜膠囊是由多孔薄殼包裹的微型液體腔室。研究人員利用微流控技術與由高分子量葡聚糖和甲基丙烯酰化明膠組成的水性兩相系統(tǒng)生成SPCs。通過調整微流控設備流速和GelMA濃度，可精確調控膠囊尺寸（35-260微米）與殼層厚度。SPCs具有出色的機械穩(wěn)定性，可耐受常規(guī)實驗室操作。其關鍵特性在于能夠完全保留大于300 bp的核酸片段，同時允許小于約200 kDa的蛋白質和試劑自由擴散，這為在常規(guī)實驗室試管中進行復雜的多步核酸分析（如單DNA分子數(shù)字PCR、單細胞RT-PCR、單基因組擴增和全基因組測序）提供了可能，同時保持了單細胞或單分子分辨率。

圖1. 半透膜膠囊的生成與特性。 (A) SPCs概念圖：類似于透析膜的薄半透殼包裹的微觀液滴，殼層允許試劑、寡核苷酸和酶通過，但能有效保留長核酸分子。(B) 利用微流控和ATPS生成SPCs。相分離后，GelMA形成外殼，經(jīng)冷卻（物理交聯(lián)）和光聚合（化學交聯(lián)）固化。(C) 熒光標記明膠制備的SPC共聚焦圖像，綠色顯示包裹液體核的薄外層。(D) 懸浮于PBS中并攜帶單個細胞的SPC明場圖像。(E) SPC在22°C下4小時內對核酸片段的大小依賴性保留。(F) SPC在22°C下對不同分子量生物分子（0.33 kDa熒光素，20 kDa FITC-葡聚糖，66 kDa BSA，160 kDa FITC-IgG）的滲透性。(G) SPC與0.1 μM FITC-BSA在22°C孵育3分鐘后的熒光圖像。(H) SPC與0.2 μM FITC-葡聚糖在22°C孵育60分鐘后的熒光圖像。比例尺：20 μm。

圖2. 使用SPCs進行核酸分析的應用示例。 (A) 對封裝在SPCs中的細胞進行核酸分析的概念圖。(B) 通過數(shù)字膠囊PCR進行單DNA分子擴增與分析（SYBR Green I染色）。(C) 靶向CD45、YAP和ACTB轉錄本的多重單細胞RT-PCR。(D) 通過phi29 DNA聚合酶對K-562細胞進行單基因組擴增，SYTO染料染色（黃色）。(E) 267個測序細胞中隨機選取的5個人類淋巴母細胞單細胞全基因組測序圈圖。比例尺：50 μm。

除了核酸分析，SPCs還支持細胞的長期生長，克服了液滴微流控的主要限制。如圖3所示，無論是懸浮細胞還是貼壁細胞，均可在SPCs內進行長達數(shù)天至數(shù)周的培養(yǎng)，形成單細胞衍生的球狀體。膠囊的彈性外殼可隨細胞增殖而膨脹超過兩倍而不破裂。通過膠原酶溫和處理，可快速分解蛋白質外殼，釋放出完整的細胞球體，且不影響細胞活性。 包被細胞還可被冷凍保存，后續(xù)仍能有效擴增為球體。

圖3. 使用SPCs形成單細胞衍生球體。 (A) 將封裝細胞擴增為球體的通用策略示意圖。(B) SPCs支持懸浮細胞（上排）和貼壁細胞（下排）的長期培養(yǎng)。(C) 通過添加膠原酶[E]釋放封閉在SPCs中的球體。(D) 培養(yǎng)1周后，使用活/死染色評估封閉在SPCs中的HCT116球體細胞活力（N = 155）。(E) 不同細胞系在5至14天內形成的單細胞衍生球體。(F) A549細胞冷凍保存后的球體形成。(G) A549細胞冷凍保存前后的活力。比例尺：50 μm。

作為SPCs的一項重要應用，研究人員開發(fā)了名為CapSeq（基于膠囊的RNA測序）的單細胞轉錄組學方法。該方法通過拆分-合并條形碼策略，可實現(xiàn)一次運行中對超過10萬個單細胞進行條形碼標記。CapSeq優(yōu)化了逆轉錄反應與條形碼步驟，在測試中平均每個細胞可檢測到超過10,000個轉錄本和3,000個基因。特別值得注意的是，CapSeq采用嚴苛裂解條件，成功捕獲了傳統(tǒng)方法難以回收的中性粒細胞等脆弱細胞類型，轉錄本回收率提高了3倍以上，展現(xiàn)出對敏感細胞類型極高的檢測靈敏度。

圖4. CapSeq用于高通量單細胞轉錄組學。 (A) CapSeq工作流程：裂解、純化、組合條形碼標記、文庫制備、測序。(B) CapSeq在K-562細胞系上的性能（UMI/細胞）。(C) 在不同裂解條件下，健康供體白細胞中中性粒細胞回收率的箱線圖。(D) CapSeq與已發(fā)表方法在中性粒細胞基因捕獲數(shù)量上的比較。

研究人員利用CapSeq對急性髓系白血病患者的白細胞進行了單細胞轉錄組分析，構建了包含86,447個轉錄組的綜合細胞圖譜。分析揭示了AML患者中不同的白血病細胞表型，這些表型在不同患者間共享，并與臨床風險分類相關。研究還發(fā)現(xiàn)，AML患者的成熟先天免疫細胞（如中性粒細胞、單核細胞）表現(xiàn)出功能失調和類干細胞的異常狀態(tài)，共享一組通常與白血病祖細胞/干細胞狀態(tài)相關的基因（如IGF2BP2, FLT3, MEIS1）的上調，表明這些成熟細胞可能處于功能改變的狀態(tài)。

圖5. 使用CapSeq對造血疾病進行轉錄分析。 (A) AML、中性粒細胞減少癥、G-CSF治療及健康個體白細胞轉錄組UMAP圖，按注釋細胞表型著色。(B) 白血病區(qū)室的力導向圖布局。(C) Hallmark通路的基因集富集分析。(D) 比較AML患者與健康供體時，先天免疫細胞類型間共享差異表達基因的UpSet圖。(E) AML患者與健康供體髓系細胞中所有顯著差異表達基因的火山圖。

為了展示SPC技術超越常規(guī)scRNA-seq應用的廣泛用途，研究團隊將CapSeq與單細胞RNA細胞計數(shù)術相結合，開發(fā)了一種基于RNA標記表達來富集并測序單細胞轉錄組的通用策略。以在AML中上調的lncRNA MIR181A1HG為例，研究人員對封裝后的細胞進行靶向熒光PCR，隨后利用FACS分選熒光陽性膠囊。測序結果證實，該方法能有效富集MIR181A1HG陽性的白血病原始細胞，展示了SPC技術在基于缺乏合適抗體的核酸標記進行表型分選與測序方面的潛力。

圖6. 基于靶向核酸標記通過FACS富集單細胞轉錄組。 (A) AML細胞與所有其他細胞相比，前100個差異表達基因的基因生物型分布。(B) 單細胞轉錄組UMAP圖，按MIR181A1HG、LNCAROD和LINC02147表達著色。(C) AML細胞與所有其他細胞相比的差異表達基因，按差異表達和統(tǒng)計學顯著性的綜合評分排序。(D) 基于目標核酸標記分選和測序單細胞轉錄組的實驗策略。(E) 四位AML患者單細胞轉錄組在基于MIR181A1HG表達分選前（左）和分選后（右）的UMAP圖，按細胞類型著色。(F) 基于MIR181A1HG表達的轉錄組分選后，陽性與陰性組分間細胞類型的差異豐度分析。

綜上所述，這項研究提出了一種基于半透膜膠囊的、廣泛適用的高通量單細胞組學研究平臺。該技術利用微流控高通量封裝單細胞，但后續(xù)所有步驟均可脫離微流控設備，使用標準實驗室移液器和試管完成，易于采納和實施。SPCs兼具水凝膠珠的溶劑交換便利性，又避免了核酸在聚合物網(wǎng)格中的物理截留問題，使核酸在液態(tài)核內自由分散，大幅提升了捕獲效率。其優(yōu)異的生物相容性支持長期細胞培養(yǎng)與克隆擴增，并通過酶解釋放實現(xiàn)細胞回收。此外，基于RNA標記的轉錄組分選策略為稀有細胞狀態(tài)研究提供了新途徑。與現(xiàn)有液滴或微孔板方法相比，SPC技術提供了更大的靈活性、可擴展性和易用性，確立了其作為下一代單細胞多組學研究的通用平臺地位。