凝膠微膠囊，登上Science！

革命性凝膠微膠囊技術(shù)CAGES問世

在當今生命科學(xué)研究中，單細胞測序技術(shù)已成為揭示細胞異質(zhì)性與動態(tài)過程的利器。然而，該領(lǐng)域長期面臨一個關(guān)鍵瓶頸：如何將需要多步操作、條件各異的基因組學(xué)分析（尤其是涉及活細胞的實驗）拓展至高通量水平。現(xiàn)有的主流技術(shù)，如微孔板、微滴或細胞內(nèi)條形碼標記，各自在通量、靈敏度或?qū)嶒瀼?fù)雜度上存在局限，難以在維持細胞活性的同時，進行復(fù)雜的多步驟分子生物學(xué)操作。

為此，哈佛醫(yī)學(xué)院系統(tǒng)生物學(xué)系的Allon M. Klein團隊開發(fā)了一項突破性技術(shù)——具有兩親性凝膠外殼的膠囊（CAGES）。CAGES能夠選擇性截留細胞和大分子分析物，同時允許培養(yǎng)基、酶和小分子試劑自由進出，從而首次實現(xiàn)了將活細胞培養(yǎng)與全基因組測序相結(jié)合的高通量多步驟實驗。研究人員還建立了相應(yīng)的膠囊內(nèi)DNA文庫條形碼標記方法，并成功應(yīng)用于對數(shù)萬個擴增細胞克隆的轉(zhuǎn)錄組進行測序，以研究基因表達程序的持久性。CAGES與多種酶促反應(yīng)的兼容性，有望極大擴展當前單細胞高通量測量的范圍，并將其延伸至活細胞分析領(lǐng)域。相關(guān)論文以“Multistep genomics on single cells and live cultures in subnanoliter capsules”為題，發(fā)表在

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這項技術(shù)的核心在于CAGES獨特的設(shè)計與制備。如圖1所示，研究人員利用微流控液滴內(nèi)的液-液相分離技術(shù)，構(gòu)建了由Pluronic F127二丙烯酸酯等兩親性聚合物形成的凝膠外殼。這種外殼具有類似泡沫的多孔結(jié)構(gòu)（孔徑10-50納米），能允許小蛋白（如DNA聚合酶）和寡核苷酸等小分子擴散通過，卻能將雙鏈DNA等大分子有效截留在膠囊內(nèi)部的液體核心中（圖1F, G, H, I）。這種可調(diào)控的通透性閾值使CAGES成為一個物理性質(zhì)穩(wěn)定的通用平臺，既能像微孔板一樣培養(yǎng)和操作單個活細胞或克隆（圖1D），又能像微滴一樣進行大規(guī)模并行處理，甚至可以通過流式細胞分選儀進行分選富集（圖1J）。

圖1：Pluronic二丙烯酸酯膠囊的概念、開發(fā)與表征。 （A）半透性膠囊示意圖及其對高通量單細胞分析的相關(guān)特性。（B）膠囊中大規(guī)模并行多步驟分析潛力示意圖，包括通過迭代添加和去除試劑、成像、分選和測序?qū)蝹€或培養(yǎng)細胞進行處理。（C）明場顯微照片（左）和示意圖（右）顯示使用微滴發(fā)生器共流動兩親性功能化外殼聚合物和親水性核心聚合物生成CAGES的過程，該體系在液滴形成時發(fā)生相分離。隨后通過405nm依賴的外殼聚合物交聯(lián)將其轉(zhuǎn)化為CAGES。紅色箭頭指示單個細胞。插圖為間隔0.12秒的兩個快照。比例尺 = 100 μm。（D）在含有單個細胞的DPBS中，8% (w/v):1% (w/v) F127DA:PPPDA外殼、13% (w/v)葡聚糖核心的CAGES的明場顯微照片。（E）明場顯微照片證明多種兩親性PEG共聚物可形成膠囊。比例尺 = 50 μm。（F）冷凍斷裂膠囊的冷凍掃描電鏡圖像，顯示Pluronic二丙烯酸酯外殼膜上孔隙的放大圖。紅色箭頭指向表面孔隙。（G）分析物擴散時間序列中膠囊的共聚焦和明場成像的示例合成顯微照片。（H）量化不同大小分析物在不同鹽濃度存在下通過CAGE外殼的擴散半衰期的強度時間序列。（I）擴散半衰期顯示CAGE通透性存在尖銳的尺寸依賴性截斷。圖表表示來自≥3次獨立實驗的平均數(shù)據(jù)，誤差條為標準差；完整數(shù)據(jù)見表S2。（J）基于流式細胞術(shù)的CAGES富集。初始含有<10%標記膠囊的樣本（左上）和分選后樣本（右上）的合成熒光和明場顯微照片，分選后產(chǎn)生約98% FITC陽性CAGES（下圖）。比例尺 = 100 μm。

為實現(xiàn)對海量膠囊內(nèi)樣本的高通量測序，團隊開發(fā)了名為“inC-seq”的靈活拆分-合并條形碼標記策略（圖2A）。該策略通過在膠囊內(nèi)進行多輪連接和PCR反應(yīng)，為每個膠囊內(nèi)的DNA文庫賦予獨特的組合條形碼。實驗證明，該方法能高效地區(qū)分來自不同膠囊的樣本，交叉污染率極低，與泊松加載模型的預(yù)期一致（圖2D）。這表明CAGES在整個復(fù)雜的多步條形碼標記過程中，能有效地隔離每個單元內(nèi)的生物材料。

圖2：基于拆分-合并策略的CAGES條形碼標記用于高通量測序（inC-seq）。 （A）膠囊內(nèi)DNA文庫拆分-合并條形碼標記示意圖，展示了本工作中使用的通過連接和PCR進行三輪條形碼標記的示例。初始文庫在共同文庫末端序列中含有一個尿嘧啶殘基（紅色），該殘基可被尿嘧啶特異性切除試劑切割，產(chǎn)生具有5‘-磷酸的黏性末端。該黏性末端與含有孔板特異性條形碼的條形碼雙鏈寡核苷酸陣列連接。重復(fù)此過程以引入第二個條形碼，并通過PCR引物引入第三個條形碼。（B）在CAGES中高效順序酶促處理DNA的演示，實現(xiàn)了（A）中的步驟（1）。初始未標記文庫（左圖）通過將膠囊在PCR反應(yīng)混合物中孵育進行擴增，PCR引物含有尿嘧啶和其3‘末端的Cy5標記。PCR和洗滌后（中圖），CAGES顯示出保留了現(xiàn)在附著在膠囊內(nèi)DNA上的Cy5熒光。尿嘧啶切除和洗滌切除了標記引物，產(chǎn)生突出端并失去Cy5熒光（右圖）。（C）五步條形碼標記方法后DNA擴增子測序數(shù)據(jù)中的條形碼表示：在擴增期間添加了14個PCR條形碼，隨后進行3步48重拆分-合并條形碼添加和膠囊溶解后的16個索引。（D）通過膠囊有效分離文庫，通過單細胞gDNA轉(zhuǎn)基因位點（編碼GFP或RFP序列）的inC-seq分析觀察到低交叉污染。圖表顯示映射到GFP或RFP的讀數(shù)數(shù)量，每個點對應(yīng)一個唯一的膠囊條形碼。觀察到的雙聯(lián)體率符合預(yù)期（2.1%），對應(yīng)于平均細胞負載為0.1個細胞/CAGE、觀察到細胞負載比例為70:30 RFP:GFP生成的CAGES。插圖為裂解前含有細胞的CAGES示例。比例尺 = 50 μm。

憑借CAGES的通用性，研究人員成功建立了多種單細胞基因組學(xué)分析方法。他們優(yōu)化了單膠囊轉(zhuǎn)錄組測序（inC-RNA-seq）和單膠囊染色質(zhì)可及性測序（inC-ATAC-seq）方案（圖3A, B）。無論是分析人鼠混合細胞以驗證樣本隔離效果（圖3C, D），還是對標商業(yè)液滴系統(tǒng)（10x Genomics）的性能，inC-RNA-seq均展現(xiàn)出高靈敏度和可重復(fù)性（圖3E）。此外，該技術(shù)還成功應(yīng)用于處理固定后復(fù)蘇、低溫凍存甚至在培養(yǎng)基中直接封裝的細胞樣本，顯示出處理復(fù)雜樣本的巨大潛力（圖3F-H）。在對人外周血單個核細胞（PBMC）的大規(guī)模分析中，inC-RNA-seq獲得了超過4.3萬個細胞的轉(zhuǎn)錄組，清晰解析了PBMC的各類細胞亞群，其性能與主流方法相當（圖3I-M）。

圖3：膠囊通過多步處理實現(xiàn)單細胞基因組學(xué)分析。 （A）inC-RNA-seq和inC-ATAC-seq文庫制備模式的示意圖。在通過逆轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)座步驟捕獲轉(zhuǎn)錄本（RTb和UMI）和可及gDNA區(qū)域（Tn5b）期間，會添加額外的條形碼和序列。捕獲并擴增的含dU分子經(jīng)過拆分-合并條形碼標記和測序。（B）顯微照片顯示在CAGES中進行單細胞RNA-seq文庫制備的連續(xù)階段，從初始細胞封裝到裂解，再到in-CAGE條形碼標記前生成擴增的互補DNA（cDNA）文庫。gDNA用SYBR Safe染料染色；cDNA用與PCR擴增引物結(jié)合的Cy5熒光團染色。（C和D）圖表顯示每個CAGE對應(yīng)的映射到人（y軸）和小鼠（x軸）RNA-seq（左）或ATAC-Seq（右）inC-seq文庫的UMI或DNA片段數(shù)量。觀察到的混合物種雙聯(lián)體率符合預(yù)期：（C）為2.1%（負載為0.083個細胞/CAGE），（D）為1.9%（負載為0.1個細胞/CAGE）。（E）對來自CAGE scRNA-seq文庫的讀數(shù)進行下采樣后，與公開可用的10x Genomics NextGem v3.1數(shù)據(jù)比較的UMI/reads圖表。（F至H）針對從新鮮或PFA固定的K562細胞（F）、新鮮或冷凍的HEK293T細胞（G）或使用DPBS或培養(yǎng)基制備的膠囊（H）生成的文庫，如（E）的UMI/reads圖表。（I）來自外周血單個核細胞（PBMC）的inC-RNA-Seq數(shù)據(jù)的二維UMAP嵌入。（J）顯示低豐度和高豐度細胞類型特異性基因覆蓋度的基因表達熱圖，以及（K）T細胞和NK細胞亞群劃分的高分辨率群體結(jié)構(gòu)。（L）如（F）生成的UMI/reads圖表，現(xiàn)針對PBMC數(shù)據(jù)生成，并比較inC-seq與10x Genomics GEMCode的數(shù)據(jù)。（M）比較inC-seq和10x Genomics NextGem v3.1之間，每個細胞檢測到的基因數(shù)量與測序深度的函數(shù)關(guān)系。

CAGES最具革命性的應(yīng)用在于其支持大規(guī)模的活細胞克隆培養(yǎng)與功能分析。通過優(yōu)化封裝條件，研究人員成功在膠囊內(nèi)培養(yǎng)了多種細胞系、小鼠原代造血干細胞乃至人誘導(dǎo)多能干細胞，且細胞在膠囊內(nèi)的分裂速度與在培養(yǎng)板中無顯著差異，轉(zhuǎn)錄組也未發(fā)生顯著改變（圖4A-C）。利用這一能力，他們設(shè)計了一項大規(guī)模平行活細胞實驗，以研究表觀遺傳記憶的持久性以及藥物對其的影響。他們將經(jīng)過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑（地西他濱、5-氮雜胞苷）或組蛋白去乙酰化酶抑制劑（伏立諾他）預(yù)處理的K562和L1210癌細胞封裝入CAGES，在持續(xù)給藥條件下培養(yǎng)6天，并分時間點對數(shù)千個克隆進行轉(zhuǎn)錄組測序（圖4D）。通過非負矩陣分解分析，他們識別出在克隆間持續(xù)異質(zhì)表達的基因程序（圖4E, F, G），其中一些程序在克隆擴增后仍保持互斥表達模式（圖4H）。

圖4：CAGES中的活細胞克隆擴增揭示了持續(xù)的基因表達程序。 （A）顯示培養(yǎng)細胞系、小鼠原代骨髓造血干細胞（mHSCs）和人誘導(dǎo)多能干細胞（hiPSCs）的克隆在CAGES中生長的顯微照片。比例尺 = 50 μm。（B）同時培養(yǎng)的封裝克隆的顯微照片。比例尺 = 100 μm。圖像顯示了在CAGES中擴增的高密度K562（多克隆）克隆。（C）在培養(yǎng)板或CAGES中培養(yǎng)的細胞的分裂時間。每個點對應(yīng)于通過延時顯微鏡評估的單個細胞分裂時間（K562: n=156；L1210: n=127）。t檢驗p值>0.8。（D）用于鑒定癌細胞系在經(jīng)載體（對照）、DNMT抑制劑（5-氮雜胞苷（Aza）；地西他濱（Dec））或HDAC抑制劑（伏立諾他（Vor））處理后，持續(xù)基因表達程序的實驗方案圖。顯微照片顯示了不同時間點的示例膠囊。（E至H）K562細胞中持續(xù)基因表達程序的證據(jù)；L1210細胞見圖S6。（E）在第4-6天K562細胞對照樣本中，克隆間基因-基因表達相關(guān)性聚類顯示出結(jié)構(gòu)化的程序證據(jù)，而當隨機將第0天取樣的細胞組合成“模擬”克隆時，這些程序消失。（F）通過非負矩陣分解（NMF）鑒定的基因表達程序的主要貢獻基因，識別出紅系、細胞周期、波形蛋白和角蛋白相關(guān)程序。完整程序負載見表S3。（G）對照克隆之間15個NMF衍生程序變異的箱線圖，顯示與模擬克隆相比，隨時間推移存在持續(xù)的異質(zhì)性。（H）一些基因表達程序在克隆擴增后仍保持互斥性，從觀察到的混合NMF程序克隆數(shù)量低于預(yù)期可以看出（觀察值/預(yù)期值 = fObs/fExp；p值來自Fisher精確檢驗）。

通過對克隆生長過程中基因程序使用情況的動態(tài)建模與統(tǒng)計推斷（圖5A, B），研究人員量化了每種藥物對特定基因程序狀態(tài)切換速率和穩(wěn)態(tài)偏好的影響（圖5C, D, E）。有趣的是，與預(yù)期相反，這些表觀遺傳藥物并未普遍降低克隆異質(zhì)性，而是以程序特異性的方式改變了狀態(tài)的持久性。例如，在K562細胞中，所有三種藥物都促使細胞向紅系分化狀態(tài)（程序3）偏移，并增加了該分化狀態(tài)的持久性（圖5C）。這些變化與單個基因的平均表達變化并不完全一致（圖5F），揭示了藥物作用更復(fù)雜的動力學(xué)層面。

圖5：DNMT或HDAC抑制劑處理后克隆記憶的改變。 （A）藥物治療對表觀遺傳記憶可能影響的示意圖。在未經(jīng)處理的對照中，細胞占據(jù)每個觀察到的程序的高和低基因表達狀態(tài)。表觀遺傳修飾酶抑制劑可能會改變狀態(tài)的相對穩(wěn)定性（上圖情景），也可能降低持久性（較淺的能阱，下圖情景）。通過對生長中的克隆進行inC-RNA-seq，可以推斷出狀態(tài)轉(zhuǎn)換速率（箭頭）。（B）通過將細胞狀態(tài)轉(zhuǎn)換的隨機模型擬合到觀察到的隨時間變化的NMF程序使用情況，從克隆inC-RNA-seq數(shù)據(jù)推斷轉(zhuǎn)換速率的方案圖。該模型用于推斷每種處理條件下每個程序的程序誘導(dǎo)速率（r01）和丟失速率（r10）（見補充文本1）。（C）以一個程序（程序3）為例的擬合轉(zhuǎn)換速率，所有藥物都增加了“高”狀態(tài)的持久性，同時使“低”狀態(tài)不穩(wěn)定。（D）從擬合的動態(tài)轉(zhuǎn)換速率得出的K562基因表達程序持久性時間的變化，顯示一些程序的克隆記憶減少（藍色），但其他程序則未減少（紅色）。（E）相應(yīng)的穩(wěn)態(tài)偏好（即活躍狀態(tài)細胞比例）變化，顯示出與程序持久性不同的變化。（F）持久性的變化與單個基因平均表達的變化不同，以K562細胞中的一種藥物（Aza）為例顯示。

總之，CAGES技術(shù)的建立為高通量單細胞及單克隆基因組分析提供了一個多功能平臺。它不僅兼容復(fù)雜的多步驟分子生物學(xué)反應(yīng)，更首次將大規(guī)模活細胞培養(yǎng)與功能性基因組讀數(shù)無縫連接。盡管當前技術(shù)在用于單細胞分析時存在空膠囊、反應(yīng)條件需優(yōu)化以及活細胞回收困難等局限性，但其在分析難處理樣本、研究細胞間相互作用（如發(fā)育或免疫互作）、大規(guī)模類器官或克隆形成實驗等方面前景廣闊。CAGES有望成為連接細胞表型與基因型的有力工具，助力構(gòu)建數(shù)據(jù)驅(qū)動的細胞動力學(xué)預(yù)測模型，推動基礎(chǔ)生物學(xué)研究和精準醫(yī)療的發(fā)展。