mBio丨中國農科院蘭獸研鄭海學團隊揭示ASFV通過病毒蛋白D117L直接劫持宿主未折疊蛋白新進展

2025年12月5日，中國農業科學院蘭州獸醫研究所鄭海學研究員團隊在國際期刊mBio（IF=4.7）上發表研究論文“Quantitative proteomic analysis identifies the unfolded protein response as a host pathway co-opted by ASFV to promote replication”。該研究通過4D無標簽定量蛋白質組學技術，首次在豬體內多器官水平描繪了ASFV感染的蛋白動態景觀。研究揭示，ASFV通過激活宿主展開未折疊蛋白反應（Unfolded Protein Response, UPR）途徑來促進病毒復制，這一發現為理解病毒-宿主相互作用提供了新視角，并為潛在抗病毒策略奠定基礎。

研究采用4D無標簽定量蛋白質組學的高分辨率技術，通過增加離子遷移維度，提高對復雜樣本中低豐度蛋白的檢測精度。相比傳統3D方法，該技術能更準確區分結構相似的肽段，適用于多器官樣本分析。

對三個器官的樣本進行蛋白提取和LC-MS/MS分析，鑒定出超過6000種蛋白。主成分分析和層次聚類顯示，生物重復間高度一致，不同器官間分離明顯。交叉分析發現，三個器官在所有時間點共有3882種核心蛋白。這些蛋白通過TCseq時間序列分析分為六個表達簇：如簇1涉及翻譯和核糖體結構，感染后表達先升后降；簇4和5富集蛋白折疊和內質網加工，表達上調。

圖1 非洲豬瘟病毒感染后豬腎、脾淋巴結和脾臟的蛋白質組學特征

進一步，使用特異性度量識別器官和感染階段特異蛋白。以SPM >0.7為閾值，腎臟和脾臟在晚期感染（7 dpi）有更多特異蛋白，如脾臟的C反應蛋白顯著上調，激活補體系統。差異表達蛋白分析顯示，脾臟DEPs最多（尤其是7 dpi），富集于ER蛋白加工、翻譯、蛋白折疊和先天免疫響應。這些DEPs的蛋白-蛋白交互網絡揭示兩個模塊：蛋白折疊和先天免疫，由EIF2AK2（也稱PKR）連接。該激酶響應雙鏈RNA，抑制翻譯，但ASFV可能通過產生dsRNA激活它，形成復雜調控。

圖2 組織特異性感染相關蛋白鑒定

基因集變異分析確認，UPR和干擾素響應在感染后激活。UPR是真核細胞應對ER壓力的保守機制，包括PERK、IRE1和ATF6三條分支，幫助恢復ER穩態或觸發凋亡。

圖3 DEPs的功能模塊失調

ASFV激活UPR的體內外證據

研究的核心發現是ASFV激活所有三條UPR分支，促進病毒復制。在體內，5-7 dpi時，UPR標志物HSPA5（也稱GRP78/BiP）在三個器官顯著上調。Western blot和qPCR驗證顯示，PERK磷酸化、IRE1磷酸化、XBP1剪接（sXBP1）和ATF6裂解增加，下游基因如DDIT3（CHOP）、ATF4和DNAJC3表達升高。這表明ASFV誘導ER應激，激活完整UPR響應。

圖4 ASFV在體內和體外激活內質網應激和未折疊蛋白反應

體外實驗在PAM細胞中證實相同模式：感染后HSPA5上調，三條分支激活，下游基因誘導。這些結果超越以往研究（如Galindo等報道的ATF6激活，或Zhong等PERK激活），首次證明ASFV在體內和體外全面劫持UPR。

病毒蛋白D117L作為UPR激活的關鍵因子

為識別病毒調控因子，團隊從22種檢測到的ASFV蛋白構建共表達網絡，發現D117L與UPR相關蛋白相關性最高。過表達實驗顯示，D117L強烈激活HSPA5和ATF6報告子，下游基因DDIT3、DNAJC3和DNAJB9轉錄增強。

圖5 D117L通過靶向關鍵的未折疊蛋白反應（UPR）組分，激活三條UPR通路

D117L含跨膜域（38-60氨基酸），突變體分析證實該域對UPR激活必需。質譜鑒定D117L交互蛋白，包括HSPA5、CANX和PDIA4。免疫沉淀和免疫熒光確認D117L與HSPA5和CANX結合，依賴跨膜域。CANX是ER伴侶，幫助蛋白折疊；HSPA5是UPR主調控者。D117L通過這些交互，直接激活三條UPR分支。

圖6 未折疊蛋白反應（UPR）的激活促進ASFV的復制

功能驗證顯示，抑制UPR（用4-PBA）或各分支（GSK2606414抑制PERK、4μ8C抑制IRE1、Ceapin-A7抑制ATF6）顯著降低病毒蛋白（p72、p54、p30）表達、mRNA轉錄和感染子代產量（TCID50測定）。siRNA敲減UPR傳感器也抑制復制，證實UPR對ASFV復制有利。

該研究為ASF防控提供靶點：設計抑制D117L-UPR交互的藥物，或UPR特異抑制劑，可能開發新型抗病毒療法。團隊建議擴展到更多器官、豬種或病毒株，結合基因編輯驗證機制。鑒于ASF全球流行，此類基礎研究有望加速疫苗和藥物開發，緩解養豬業壓力。