《食品科學》：西北農林科技大學袁春龍博士等：Zn-金屬有機骨架固定脂肪酶及其對赭曲霉毒素A的高效降解

赭曲霉毒素A（OTA）是由黑曲霉、赭曲霉或石炭曲霉等真菌產生的次生代謝物，已被國際癌癥研究機構列為2B類致癌物。飲食攝入是人們接觸OTA的主要途徑。生物解毒被認為是減少OTA污染的新策略。

近年來眾多研究報道了酵母、芽孢桿菌和無毒真菌等能夠通過細胞吸附或產酶降解OTA，而酶法降解OTA因其高效、便捷和不消耗食品本身營養物質而被廣泛應用。然而大部分天然酶的本質是蛋白質，其結構并不穩定，通過將酶固定則可以解決這一問題。各種類型的材料，包括天然或合成聚合物和無機材料，以不同的方式用作酶固定的支持物。眾多載體中，金屬有機骨架（MOF）因孔徑均勻、比表面積大、生物相容性良好的優點備受關注。MOF是由金屬離子和有機配體（連接體）通過配位鍵連接而成的納米晶體材料，在氣體儲存、藥物輸送、催化、傳感等領域都有廣闊的應用前景。Zn-MOF作為載體，可通過一步原位固定法實現酶負載，不僅能夠節約合成時間，而且該方法條件溫和、固定后的酶穩定性較好，因此可用于OTA降解酶的固定。

源自Aspergillus niger的脂肪酶A（ANL），可以通過水解破壞OTA的酰胺鍵將其轉化為赭曲霉毒素

和苯丙氨酸。為提高ANL對OTA的降解效率， 西北農林科技大學葡萄酒學院的郇佳欣、黃燕萍、袁春龍*等 研究采用原位一步合成法將ANL負載到Zn-MOF上，制備Zn-MOF固定化脂肪酶（ANL

Zn-MOF），通過優化合成參數和系列表征技術探究ANL

Zn-MOF的物理化學特性，同時以OTA降解率為評價指標系統探究ANL

Zn-MOF對OTA的降解性能及其影響因素，明確ANL

Zn-MOF循環使用的穩定性，以期為酶法去除食品及飼料中的OTA提供新思路。

1 ANL

Zn-MOF的表征結果

為了明確ANL負載后Zn-MOF的理化性質，采用多種表征手段系統探究了Zn-MOF和ANL

Zn-MOF的形貌、晶體結構、表面官能團和熱穩定性。由圖1a可知，Zn-MOF為板狀且大小均勻。與Zn-MOF相比，由0.6 mg/mL ANL制備的ANL

Zn-MOF形狀和大小略有變化，但仍為板狀（圖1b）。隨著合成體系中ANL質量濃度的升高，ANL@Zn-MOF仍然保持板狀（圖1c、d），說明在本實驗條件下，Zn-MOF合成體系中ANL的添加量對Zn-MOF的形態基本無顯著影響。

如圖2a所示，Zn-MOF中的有機芳香配體在3 340～3 100、1 600～1 550、1 500～1 430 cm-1和900～700 cm-1處有明顯的特征峰，其中3 319 cm-1處的峰是由于N—H的伸縮振動。1 558 cm-1和1 398 cm-1處的峰對應羧基的不對稱和對稱拉伸。1 431 cm-1處的小峰對應與Zn-MOF鍵合的去質子化羧酸離子；ANL@Zn-MOF的紅外光譜不僅存在Zn-MOF的特征峰，而且由于ANL的負載導致ANL@Zn-MOF在3 319 cm-1處的特征吸收峰明顯增強，說明ANL@Zn-MOF成功合成。此外，與Zn-MOF相比，ANL@Zn-MOF并未出現新的吸收峰，表明ANL是以物理吸附的方式固定于MOF之中。物理吸附的實現可能是因為ANL@Zn-MOF具有較大的比表面積，為酶的物理固定提供了充足的吸附位點，且其表面存在羧基基團，這些羧基具有較強的極性，能夠與酶分子通過氫鍵和靜電相互作用，從而實現了ANL在Zn-MOF上的有效固定。通過對游離ANL和ANL@Zn-MOF的蛋白質結構特征吸收峰分析可知，ANL在1 658 cm-1處的峰值是脂肪酶的α-螺旋結構導致酰胺I鍵的C＝O拉伸振動，而ANL@Zn-MOF在1 658 cm-1處的峰值移至1 620 cm-1處，這可能是Zn-MOF多孔結構對ANL的束縛導致ANL的

-螺旋結構變為聚集鏈，且500～700 cm -1 酰胺帶的峰強度增加進一步證明ANL成功固定于Zn-MOF中。

本實驗采用XRD分析ANL

Zn-MOF和Zn-MOF的晶體特性，結果如圖2b所示。Zn-MOF在10.7°、19.42°、24.06°、26.14°處有顯著的特征衍射峰。同樣，ANL

Zn-MOF也顯示了Zn-MOF的特征衍射峰，說明Zn-MOF負載ANL前后的晶體結構未發生變化，由于脂肪酶負載到Zn-MOF中，部分衍射峰發生偏移。

為了明確負載前后Zn-MOF的熱穩定性，分別測試了ANL

Zn-MOF、Zn-MOF和ANL在30～700 ℃范圍內的質量損失，結果如圖2c、d所示。對于Zn-MOF而言，在100～160 ℃范圍內觀察到輕微（近3.38%）的質量損失，主要是Zn-MOF粉末中存在的游離水蒸發所致；在189～224 ℃范圍內觀察到2.15%的質量損失，這是由于與MOF結構緊密結合的水分蒸發；由于Zn-MOF的結構分解，在380～550 ℃范圍內觀察到較大的質量損失（近38.71%）。在ANL

Zn-MOF中同樣發現，由于MOF和脂肪酶中水分子的損失，在110～180 ℃有相對較大的質量損失（近10.39%） ；由于脂肪酶的湮滅，ANL

Zn-MOF的質量損失始于270 ℃左右，一直持續到550 ℃ 。通過差熱分析可知，在120～550 ℃范圍內，ANL

Zn-MOF的質量損失率高于Zn-MOF，這種較大的質量損失是因為Zn-MOF中存在ANL，尤其在380 ℃時ANL

Zn-MOF的質量損失比Zn-MOF高約14.4%，這進一步證實了ANL成功固定在Zn-MOF中。

2 Zn-MOF對ANL固定的條件優化

為了提高Zn-MOF對ANL負載量，本實驗對ANL

Zn-MOF合成時酶的添加量、合成時間及攪拌速率進行了優化，以OTA降解率確定ANL

Zn-MOF制備的工藝參數。如圖3a所示，當ANL質量濃度為0.2～1.0 mg/mL時，Zn-MOF對ANL的固定率隨酶質量濃度的升高呈先降低后升高的趨勢，但當體系中ANL的質量濃度高于1.0 mg/mL時，Zn-MOF對ANL的固定率趨于平穩。當ANL質量濃度為1 mg/mL時，ANL

Zn-MOF對OTA的降解率最高，達到了69.9%。因此，確定在ANL

Zn-MOF制備過程中ANL的質量濃度為1 mg/mL。反應時間不僅影響ANL與Zn-MOF的相互作用，也對Zn-MOF晶體形成至關重要。如圖3b所示，Zn-MOF對ANL的固定率和ANL

Zn-MOF對OTA的降解率隨著合成時間的延長呈現先增大后減小的趨勢。在合成時間為2 h時，ANL

Zn-MOF對OTA的降解率達到最高（71.8%），因此確定ANL

Zn-MOF的最佳合成時間為2 h。攪拌速率影響ANL

Zn-MOF合成體系中各物質之間的相互作用。由圖3c可知，在400 r/min的攪拌條件下ANL的固定率最高，達到23.7%，且該條件下制備的ANL

Zn-MOF對OTA的降解率較高（73.0%）。因此，制備ANL

Zn-MOF的最佳條件為ANL質量濃度1.0 mg/mL、合成時間2 h、攪拌速率400 r/min，在該條件下酶載量可達155 mg/g。

3 ANL

Zn-MOF對OTA的降解分析

3.1 體系中ANL濃度和反應時間對OTA降解率的影響

為了明確ANL

Zn-MOF中ANL是否具有OTA降解能力，本實驗以游離的ANL為對照，以ANL質量濃度和反應時間為變量，對比了ANL和ANL

Zn-MOF對OTA的降解效果。由圖4可知，隨著反應時間的延長，二者對OTA的降解率逐漸升高，說明Zn-MOF本身對ANL活性無影響；但在相同的ANL質量濃度條件下，ANL

Zn-MOF對OTA的降解率比ANL高。體系中添加的ANL質量濃度越大，OTA的降解率越高。對于游離的ANL而言，當其質量濃度為20、30 ng/mL時，經過24 h后其對OTA的降解率高達100%，而ANL

Zn-MOF中的ANL質量濃度為10 ng/mL即可在24 h內完全降解OTA，這表明經Zn-MOF固定后顯著提高了ANL對OTA的降解能力，且在相同酶濃度下，ANL

Zn-MOF對OTA的降解能力更強，ANL

Zn-MOF（其中ANL質量濃度為20 ng/mL）能在8 h內完全降解OTA，比游離ANL完全降解OTA的時間縮短了66.7%，這可能是因為游離的酶分子在溶液中相比于固定酶更容易發生聚集現象，導致活性位點被遮蔽。而固定化可以將酶分子分散并固定在載體上，避免酶分子之間的相互聚集，保持了酶的活性。同時Zn-MOF可以為ANL提供一個相對穩定的微環境，保護ANL的活性結構，防止其在反應過程中發生變性或失活。這使得ANL能夠保持較高的活性，持續有效地對OTA進行降解。

3.2 不同條件下ANL

Zn-MOF對OTA的降解情況

3.2.1 pH值

體系pH值的變化可以引起酶構象變化或底物電荷特性等性質的改變，對酶活性影響較大。由圖5a可知，pH值對ANL

Zn-MOF和ANL的OTA降解能力具有顯著影響，隨著體系pH值的升高，二者的OTA降解率呈現先上升后下降的趨勢，且當pH 7.0時OTA的降解率最高。而在偏酸性和堿性條件下，ANL

Zn-MOF和ANL的活性均降低。這可能是在較低或較高pH值條件下，由于ANL的變性或其構象改變削弱了活性位點與OTA的相互作用。此外，在酸性環境中ANL

Zn-MOF的OTA降解率略低于ANL，在堿性環境中ANL

Zn-MOF對OTA的降解率比ANL高出20%以上。這可能是由于NH 2 -BDC的羧基帶負電荷，降低了ANL吸附位點周圍的pH值，因此在反應體系pH值較高的情況下，ANL

Zn-MOF對OTA的降解率仍能保持較高的水平。這種將酶固定后導致其pH值最適區域向酸性或堿性方向轉變的情況在其他酶中也觀察到。

3.2.2 溫度

溫度通過增加自由能水平從而降低或升高酶促反應的活化能，進而改變酶-底物復合物中的相互作用。由圖5b可知，隨著溫度由25 ℃升高至75 ℃，ANL

Zn-MOF和ANL對OTA降解率均呈現先升高后降低，且ANL

Zn-MOF的OTA降解率均高于ANL，尤其是在45 ℃條件下ANL

Zn-MOF對OTA的降解率高達73%。與ANL相比，ANL

Zn-MOF具有較好的熱穩定性，在體系溫度為65 ℃及以上時，ANL

Zn-MOF仍能夠降解體系中的OTA，降解率高于30%。這可能是因為ANL負載在Zn-MOF后其三維構象更加穩定，從而防止其催化中心的變性。

3.2.3 體系離子強度

在酶促反應的過程中，底物或酶分子中具有催化作用的氨基酸發生電離，而在離子強度不同的情況下，酶分子的氨基酸殘基可能會發生質子化或去質子化反應，并影響底物的結合和轉化。而且考慮到ANL特殊的作用機制，反應體系的離子強度會影響ANL活性中心的開放和關閉程度，因此本實驗探究了體系中離子強度對ANL

Zn-MOF的OTA降解效果的影響，結果如圖5c所示。隨著磷酸鹽緩沖液濃度的增加，ANL

Zn-MOF和ANL的OTA降解率均呈先升高后降低的趨勢，這是因為高離子強度不利于ANL活性中心的暴露，從而影響ANL

Zn-MOF和ANL對OTA的降解能力。值得注意的是，在離子濃度高達24 mmol/L的條件下，ANL

Zn-MOF的OTA降解率比ANL高出20%左右。且ANL

Zn-MOF的OTA降解率始終高于ANL；當磷酸鹽緩沖液濃度為12 mmol/L時，ANL

Zn-MOF的OTA降解率達到最高值，為74.8%，ANL的OTA降解率為40.0%。

3.2.4 反應體系體積

由圖5d可知，隨著反應時間的延長，2 種反應體系（5、500 mL）下ANL

Zn-MOF對OTA的降解率均逐漸升高。在相同的時間條件下，5 mL反應體系的降解率始終高于500 mL反應體系。這表明反應體系體積對ANL

Zn-MOF降解OTA的效果有影響。在5 mL的反應體系中，ANL

Zn-MOF對OTA的降解率更高，可能是因為在較小的體系中底物和催化劑的分布相對更加均勻，分子間的有效碰撞幾率更高，從而使得降解反應能夠更快速有效地進行。而在較大的反應體系（500 mL）中，底物和催化劑的擴散相對較慢，可能導致局部濃度不均勻，影響了反應的進行速度和最終的降解效率。盡管如此，在較大的反應體系下ANL

Zn-MOF仍能在12 h內降解69.3%的OTA。同時，較小體系中OTA的降解率更高也可能是因為受外界干擾因素相對較少，有利于維持反應的高效進行。

3.2.5 ANL@Zn-MOF的循環使用性

固定化酶可以循環使用，且在循環使用的過程中能保持酶原有的催化性能，明確固定化酶的循環特性對其工業應用至關重要。如圖5e所示，ANL

Zn-MOF對OTA的降解率在使用2 次后緩慢下降，在使用5 次后ANL

Zn-MOF仍能保留78%的相對活性。ANL

Zn-MOF的活性降低可能是由于ANL的分離和失活，以及離心和洗滌過程中固定化酶的損失。對重復使用5 次后ANL

Zn-MOF的形貌觀察可知，ANL

Zn-MOF依然保持原來的板狀（圖5f），說明其具有較好的穩定性，能夠根據需求循環使用。

結論

為了解決ANL在降解OTA時存在的穩定性差和難以循環利用的難題，本實驗通過一步原位固定法制備了ANL

Zn-MOF，其最優制備條件為酶質量濃度1 mg/mL、合成時間2 h、攪拌速率400 r/min，同時考察了不同pH值、溫度、離子強度和反應體系體積條件下ANL

Zn-MOF對OTA的降解情況。結果表明，經Zn-MOF固定拓寬了ANL的溫度使用范圍，增強了其耐堿性，在pH＞7、溫度高于65 ℃和離子濃度高達24 mmol/L的條件下，ANL

Zn-MOF的OTA降解率比ANL高出20%左右，在較大的反應體系下ANL

Zn-MOF仍能在12 h內降解69.3%的OTA。同時ANL

Zn-MOF具有較好的穩定性，循環使用5 次仍能保持其78%的OTA降解能力。本研究可為后續利用ANL

Zn-MOF降解食品體系中的OTA奠定基礎。

本文《Zn-金屬有機骨架固定脂肪酶及其對赭曲霉毒素A的高效降解》來源于《食品科學》2025年46卷第16期175-182頁，作者：郇佳欣，黃燕萍，牛彥哲，宋宏，劉滿順，袁春龍*。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20241227-237。點擊下方閱讀原文即可查看文章相關信息。

實習編輯：劉芯；責任編輯：張睿梅。點擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網