FSHW | Per2通過影響肝臟PPARα/RXRα/FGF21通路阻斷木犀草素誘導的小鼠脂肪細胞褐變

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Introduction

肥胖作為一種全球性的流行性代謝疾病，被認為從根本上是由能量攝入和能量消耗之間的長期不平衡引起的。已經鑒定出2 種類型的解偶聯蛋白1（UCP1）陽性脂肪細胞，來自棕色脂肪組織（BAT）的經典棕色脂肪細胞和來自白色脂肪組織（WAT）的米色脂肪細胞，可將儲存的化學能轉化為熱量。促進棕色/米色脂肪細胞褐變以增加能量消耗，被認為是對抗肥胖及其并發癥的有力治療策略。

越來越多研究報道能量攝入和消耗的晝夜節律紊亂，促進了肥胖及其相關代謝疾病的發生及發展。生物鐘功能障礙增加了脂肪細胞儲存甘油三酯的能力，降低了脂肪細胞對各種激素的敏感性，最終導致肥胖和相關代謝疾病，如2型糖尿病。Per2是小鼠和人類生物鐘的重要組成部分。先前的研究表明，PER2 SNP（rs2304672 C > G 和rs4663302 C > T）與腹部肥胖和致肥胖行為密切相關。作為對冷暴露的反應，核心時鐘蛋白Per2作為PPARα的共激活劑增加UCP1的表達以激活脂肪細胞褐變。另外一個核心時鐘基因Bmal1，通過直接轉錄控制TGF-β/BMP信號通路抑制棕色脂肪生成和產熱能力。

木犀草素（3',4',5,7-四羥基黃酮）是一種最常見的類黃酮之一，廣泛分布于許多食用和藥用植物中，如芹菜、菠菜和金銀花。在最近的報道中，木犀草素可以通過肝臟和脂肪組織之間的相互作用來改善肥胖的發展及其并發癥。之前的研究表明，木犀草素增強了高脂飲食（HFD）或低脂飲食（LFD）喂養小鼠的棕色脂肪細胞活性和米色脂肪細胞的形成。然而，目前尚不清楚晝夜節律時鐘基因和時鐘控制基因的節律表達是否介導了木犀草素對飲食誘導的肥胖和脂肪細胞褐變的影響。

因此，合肥工業大學的鄭磊、劉健等，在本研究利用HFD喂養的野生型（WT）小鼠，探討了飲食補充木犀草素對能量代謝和脂肪組織UCP1晝夜節律的影響。隨后，在小鼠的脂肪組織和肝臟中檢測時鐘蛋白Per2和Bmal1的節律改變。此外，利用Per2缺失（Per2-/-）小鼠揭示了Per2介導了肝臟PPARα/RXRα/FGF21信號轉導，進而闡明Per2通過削弱肝臟PPARα/RXRα/FGF21通路阻斷木犀草素誘導的小鼠脂肪細胞褐變。

結果與討論

膳食木犀草素（木犀草素）改善了高脂飲食（HFD）誘導的野生型（WT）小鼠能量代謝節律紊亂

圖1 膳食木犀草素（木犀草素）改善了高脂飲食（HFD）誘導的野生型（WT）小鼠的肥胖和能量代謝節律紊亂

5周齡雄性C57BL/6 WT小鼠分別給予LFD、HFD和HFD + 0.01%木犀草素喂養12周。與LFD相比，HFD導致小鼠體質量（圖1A）和代謝組織質量（圖1B）增加加劇，血清脂質和葡萄糖水平增高（圖S1）。相反，膳食木犀草素顯著逆轉了這些不良的代謝變化（圖1A和B），這與課題組之前的研究結果一致。同時，3組處理的小鼠攝食量無顯著性差異（圖1C）。與LFD喂養的小鼠相比，HFD喂養的小鼠表現出活動量下降（圖1D）。有趣的是，膳食木犀草素顯著增加了小鼠的自主活動（圖1D），表明木犀草素增加了小鼠的能量消耗。HFD喂養小鼠的O2消耗和CO2產生顯著降低，晝夜節律表達較弱，飲食木犀草素處理顯著增加了這兩個參數的水平（圖1E和F）。與LFD小鼠相比，HFD組小鼠BAT中UCP1蛋白水平在夜間降低，導致晝夜節律減弱（圖1G）。在HFD喂養的小鼠SAT中，由于UCP1在所有時間點表達量很低，幾乎失去了其晝夜節律（圖1H）。雖然膳食木犀草素未能完全恢復LFD喂養小鼠UCP1的節律性表達，但在夜間，顯著提高了BAT和SAT中UCP1的水平（圖1G和H）。因此，膳食木犀草素通過增加脂肪組織棕脂化，改善了HFD喂養的WT小鼠能量消耗的晝夜紊亂。

膳食木犀草素同步提高HFD喂養的WT小鼠肝臟PER2表達和脂肪組織UCP1水平

圖2 膳食木犀草素（木犀草素）改善了高脂飲食（HFD）誘導的野生型（WT）小鼠BAT、SAT和肝臟核心時鐘基因的節律性表達

為了評估核心生物鐘基因在調節脂肪組織UCP1水平中的作用，本研究接下來檢測了BAT和SAT中PER2和BMAL1的表達。與LFD小鼠相比，HFD小鼠BAT和SAT中PER2和BMAL1的表達水平較低，且振幅較小（圖2A和B）。相反，膳食木犀草素促進了這2 種生物鐘蛋白的節律性表達，基本完全恢復到LFD 小鼠中的節律性表達（圖2A和B）。在HFD + 0.01%木犀草素喂養小鼠脂肪組織中，核心時鐘蛋白和UCP1之間的表達模式不同步，表明來自其他組織的晝夜節律信號可能調節脂肪組織棕脂化。

肝臟是負責類黃酮利用的重要器官，也是食物攝入后最典型的外周生物鐘表達模型。因此，作者進一步檢測了肝臟中核心生物鐘蛋白的表達。HFD小鼠在所有時間點的肝臟PER2水平均低于LFD小鼠，即PER2節律平緩（圖2C）。有趣的是，膳食木犀草素有效地增加了夜間PER2的蛋白水平（圖2C），這與木犀草素激活的SAT和BAT中UCP1的表達相似（圖2A和B）。相對于PER2水平的變化，所有小鼠中BMAL1表達的變化要弱得多（圖2C）。結果表明，膳食木犀草素可能通過肝臟PER2介導的信號通路促進HFD WT小鼠脂肪組織棕脂化。

木犀草素節律性激活HFD喂養的WT小鼠肝臟PPARα/RXRα/FGF21信號通路

圖3 膳食木犀草素（木犀草素）節律性激活高脂飲食（HFD）誘導的野生型（WT）小鼠PPARα/RXRα/FGF21信號通路

為了解膳食木犀草素是否通過脂肪組織和肝臟之間的相互作用激活脂肪組織棕脂化，進一步檢測了與脂肪組織UCP1表達和系統性能量代謝有關的關鍵肝臟激素：FGF21。在LFD喂養的小鼠中，肝臟和血清FGF21水平展現出強烈的晝夜節律變化，峰值出現在08:00時（圖3A和B）。與LFD相比，HFD顯著下調了肝臟中FGF21的mRNA和蛋白水平，并削弱了其節律性表達（圖3A和C）。肝臟FGF21合成減少嚴重降低了HFD小鼠08:00的血清FGF21水平（圖3B）。相反，木犀草素顯著提高了肝臟和血清中FGF21水平，尤其是在08:00時間點（圖3C）。PPARα與RXRα異源二聚體可以誘導肝臟中FGF21的節律性表達，于是課題組進一步檢測了木犀草素是否通過PPARα/RXRα信號促進FGF21水平。與LFD相比，HFD顯著降低了肝臟中

PPAR

RXR

PPAR

RXR

Per2基因敲除消除了高脂喂養小鼠中木犀草素誘導的脂肪組織棕脂化

圖4 膳食木犀草素（木犀草素）不調節高脂飲食（HFD）誘導的Per2-/-小鼠的能量代謝

鑒于在HFD喂養的WT小鼠中木犀草素介導的肝臟PER2和脂肪組織UCP1的同步化，作者推測PER2在木犀草素激活的能量消耗中起關鍵作用。因此，對Per2-/-小鼠進行為期12周的HFD和HFD + 0.01%木犀草素喂養，包括以下三組：HFD喂養的WT小鼠、HFD喂養的Per2-/-小鼠、HFD喂養的Per2-/-小鼠膳食補充木犀草素。發現三組小鼠中O2消耗和CO2產生等代謝參數、BAT和SAT中UCP1的幅度和水平均無顯著差異（圖4）。這些數據表明，在HFD喂養的小鼠中，Per2缺失阻斷了木犀草素激活的脂肪組織棕脂化。

Per2缺失減弱肝臟PPARα/RXRα/FGF21通路

圖5 木犀草素對PPARα/RXRα/FGF21通路的影響在HFD喂養的Per2-/-小鼠中弱于WT小鼠

鑒于膳食木犀草素促進脂肪組織棕色化并影響肝臟PPARα/RXRα/FGF21通路（圖1和3），課題組接下來檢測了Per2-/-小鼠中木犀草素對PPARα/RXRα/FGF21通路的影響。WT小鼠中木犀草素引起的FGF21變化百分比遠大于Per2-/-小鼠（圖5A和B）。例如，WT小鼠血清FGF21在08:00的增加量為84.05 %，高于Per2-/-小鼠觀察到的28.81%（圖5B）。與WT小鼠組相比，Per2-/-小鼠飲食木犀草素引起的Pparα和Rxrα mRNA水平的增率顯著降低（圖5C和D）。在8:00，WT小鼠的Pparα水平上調至128.80 %，約為Per2-/-小鼠（39.04 %）的3 倍（圖5C）。綜上所述，Per2的缺失削弱了膳食木犀草素對PPARα/RXRα/FGF21通路的影響。

木犀草素直接增加了WT小鼠原代培養肝細胞中PPARα/RXRα/FGF21分子的表達，而對Per2-/-小鼠無影響

圖6 木犀草素直接增加了WT小鼠原代培養肝細胞中PPARα/RXRα/FGF21分子的表達，而對Per2-/-小鼠無影響

為了確認木犀草素對肝臟的直接作用，使用10 μmol/L 木犀草素處理分別來自WT和Per2-/-小鼠的原代肝細胞。在WT小鼠原代肝細胞中，木犀草素刺激18~24 h的Pparα和Rxrα的mRNA水平。下游靶基因Fgf21在木犀草素刺激18 h后顯著增加（圖6C）。與此相反，木犀草素對Per2-/-小鼠（圖6A~C）原代培養肝細胞Pparα、Rxrα和Fgf21的mRNA表達影響較小。這些結果表明，木犀草素直接激活WT小鼠原代培養肝細胞中的肝臟PPAR α/RXRa/FGF21通路，而不是Per2-/-小鼠。綜上所述，飲食補充木犀草素促進WT小鼠SAT和BAT中脂肪細胞產熱，而Per2敲除后，通過減弱PPARα/RXRα/FGF21通路，阻礙木犀草素誘導的脂肪組織棕脂化（圖6D）。

Conclusion

這項研究揭示了在HFD喂養的小鼠中膳食補充木犀草素可激活肝臟PER2介導的 PPARα/RXRa/FGF21 信號，促進脂肪細胞褐變。膳食補充木犀草素改善了HFD喂養的WT小鼠能量消耗的異常晝夜節律，而核心時鐘基因Per2缺失消除了膳食補充木犀草素對HFD喂養的Per2-/-小鼠脂肪組織褐變和產熱的影響。

第一作者簡介

水珊珊，食品科學博士/博士后，副教授，浙江海洋大學食品與藥學學院專任教師，主要研究方向為水產食品分子營養，水產品加工及貯藏。主持國家自然科學基金青年基金項目、舟山市科技專項、研究生教育質量系列工程項目等5 項；參與國家重點研發計劃項目、國家自然科學基金聯合基金項目、浙江省高等教育“十四五”教學改革項目、浙江省“十四五”研究生教學改革項目等6 項；以第一或通訊作者發表sci和中文高質量期刊論文20余篇；參與申請或授權國家專利11 項；獲浙江省優秀研究生教學案例、舟山市自然科學優秀論文等獎項；指導學生成功申報省部級及以上項目4 項、獲省部級及以上獎項3 項。

陳娟，博士，碩士生導師，生物醫學工程專業，合肥工業大學食品與生物工程學院講師。研究方向：利用生物信息多組學研究方法，從RNA編輯視角研究重大代謝疾病發生機理，并關注食品源天然黃酮小分子改善機體代謝的調控機理研究。主持國家級項目1 項，安徽省自然科學基金1 項。近五年來，以第一作者或通訊作者在Journal of Agricultural and Food Chemistry、Phytomedicine、Communications biology等國際著名期刊發表學術論文多篇；指導學生獲得省部級及以上獎項3 項。

通信作者簡介

劉健，博士/博士后，教授，博士生導師，“黃山學者”特聘教授。中國生物物理學會代謝生物學分會理事，安徽省檢驗檢測學會理事長、安徽省生物化學與分子生物學會副理事長、安徽省細胞生物學會常務理事，高質量學術期刊Journal of Nutritional Biochemistry、Food Science and Human Wellness編委。研究領域：肥胖與代謝疾病調控機制研究及相關食藥產品開發；近10年來，主持國家自然科學基金面上項目等縱橫向項目10余項，團隊總到賬經費逾1 000萬元。發表高質量論文40余篇。

鄭磊，博士/研究員，博士生導師，現任合肥工業大學校長，“黃山學者”特聘教授、“食品安全”中青年創新群體帶頭人。本科及碩士、博士均畢業于中國科學技術大學，“郭沫若獎”獲得者。現為校學位委員會委員、校學術委員會委員兼生化材料學部主任、安徽省農業生態與質量安全產業技術體系副首席專家、中國細胞生物學會生物節律專業委員會委員、國家食品藥品監督管理總局（CFDA）特殊醫學用途配方食品/特殊膳食食品抽檢監測牽頭工作專家委員會委員，《科技導報》、《食品科學》、《食品工業科技》等核心期刊編委，省部級重點實驗室學術委員會委員。主要從事食品安全分析檢測、腸道營養健康研究，以及物質科學與生命科學交叉領域的研究工作，主持國家重點研發計劃“食品安全重點專項”項目“糧油食品供應鏈危害物識別與防控技術研究”等項目十余項，以第一完成人獲省部級科技獎勵一等獎1 項、三等獎1 項，參與制修訂國家標準6 項，發表高質量論文100余篇。指導的研究生獲安徽省“互聯網+”大學生創新創業大賽金獎和全國“研究生智慧城市技術與創意設計大賽”優勝獎。

Deficiency of circadian gene Per2 blocks luteolin-induced adipocyte browning in mice through weakening liver PPARα/RXRα/FGF21 pathway

Shanshan Shuia,b,1, Juan Chena,1, Yan Lina, Jingjing Yuana, Xin Wanga, Xian Zhanga, Jian Liua,c,*, Lei Zhenga,c,*

a School of Food and Biological Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China

b Key Laboratory of Health Risk Factors for Seafood of Zhejiang Province, College of Food Science and Pharmacy, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China

c Engineering Research Center of Bio-process, Ministry of Education, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China

1These authors contribute equally.

*Corresponding authors.

Abstract

During the development of diet-induced obesity, the change of energy matebolism is closely related to the function of the circadian clock in mammals. Luteolin (LU), one of the most common natural flavonoids riched in many edible plants, can ameliorate obesity by activating adipose tissue browning, but its effect on circadian clock in this process remains poorly understood. Here we found that dietary LU improved circadian misalignment of energy expenditure in high-fat diet (HFD)-fed wild-type (WT) mice. Moreover, dietary LU efficiently elevated uncoupling protein 1 levels in adipose tissue during the dark period, which was similar to the LU-increased hepatic PER2 expressions. Hepatic peroxisome proliferators-activated receptors α (PPARα)/recombinant retinoid X receptor α (RXRα)/fibroblast growth factor 21 (FGF21) pathway was rhythmically elevated by dietary LU in HFD-fed WT mice, whereas the promotion was inhibited in Per2-/- mice. Meanwhile, Per2 deletion abolished the effects of dietary LU on adipose tissue browning in HFD-fed mice. Further, LU treatment directly activated PPARα/RXRα/FGF21 signaling in primary cultured hepatocytes from WT mice rather than Per2-/- mice. Taken together, the deletion of the core clock component Per2 impedes LU-induced adipose tissue browning through weakening PPARα/RXRα/FGF21 pathway in mice, providing a new insight into the interplay of energy metabolism and circadian clock for the anti-obesity activity of LU.

Reference:

SHUI S S, CHEN J, LIN Y, et al.Deficiency of circadian gene Per2 blocks luteolin-induced adipocyte browning in mice through weakening liver PPARα/RXRα/FGF21 pathway[J]. Food Science and Human Wellness, 2025, 14(3): 9250058. DOI:10.26599/FSHW.2024.9250058.

本文編譯內容由作者提供

編輯：王佳紅；責任編輯：孫勇

封面圖片：圖蟲創意