《食品科學》：安徽工程大學張會敏博士等：濃香型白酒發酵體系己酸菌液的連續富集及其“增己降乳”功能

中國濃香型白酒發酵是在傳統泥窖中由混合菌群進行的固態分批發酵。濃香型白酒發酵體系是一個典型的己酸合成代謝體系。窖泥是己酸生成菌（以下簡稱“己酸菌”）等厭氧菌的持續釋放源，在每個批次的發酵后期與酒醅發酵沉積形成的黃水混合形成“窖泥-黃水微發酵體系”進行代謝。發酵結束后，溶解于乙醇-水混合物中各種微生物的代謝產物與乙醇一起經過蒸餾形成濃香型白酒的風味成分。目前的研究表明，與“窖泥-黃水微發酵體系”共存的窖池底部酒醅蒸餾得到的白酒品質最好。其中的己酸和己酸乙酯含量相對較高。增加己酸降低乳酸，通過酸醇酯化增加己酸乙酯的含量并同時降低乳酸乙酯的含量，即“增己降乳”有利于提高濃香型白酒的發酵品質。

安徽工程大學生物與食品工程學院的王秀本、張會敏*和安徽文王釀酒股份有限公司的常強等為探究窖泥與黃水空間異質性情況下連續分批發酵窖泥對黃水己酸菌群及其己酸合成代謝的影響，模擬濃香型白酒發酵后期窖泥-黃水微發酵體系分別設計接種窖泥的“窖泥-黃水微發酵體系”（受窖泥影響大）和無接種窖泥的“黃水微發酵體系”（受窖泥影響小）并進行連續4 輪發酵，分別分析兩者連續分批發酵后原核菌群結構、代謝產物和理化參數的變化規律，以期為解析窖泥在濃香型白酒實際生產過程中的己酸合成代謝規律和己酸菌合成代謝提供理論基礎。

1 新鮮窖泥與黃水樣本的理化參數

如表1所示，HS組中富含己酸菌群生長所需要的碳源（葡萄糖、乳酸、乙醇）、氮源（銨態氮）以及磷元素（有效磷）等，這與前人研究結果基本一致。與HS組相比，PM組中可以作為碳源的葡萄糖、乳酸、乙醇以及己酸合成（中間）代謝產物乙酸、丁酸、己酸等成分含量較低，推測可能與窖泥菌群固態發酵過程較慢的熱交換和代謝反應率有關。此外，與HS組相比，PM組的pH值相對更偏中性，銨態氮與有效磷含量更豐富，推測可能因為固態窖泥阻擋強酸性黃水滲透，此外窖泥中存在降解乳酸和蛋白的菌群，如可降解乳酸的

Caproiciproducens

和可降解蛋白的

Aminobacterium

，有助于提高pH值，同時提高銨態氮和有效磷的含量。

2 “窖泥-黃水微發酵體系”連續厭氧培養后原核菌群結構組成及其

多樣性

通過對“窖泥-黃水微發酵體系”連續培養的PSF1～PSF4樣本進行16S rRNA V4區擴增子高通量測序，共獲得736 005 條優質序列，抽平后60 339 條序列/樣本。4 個連續培養菌群樣本的測序覆蓋率均大于99.99%，表明測序結果可以反映其原核菌群結構。4 個樣本中的ASV數目依次增加（109.00±4.24～147.00±1.41），表明“窖泥-黃水微發酵體系”連續培養過程中，菌液中的原核菌群種類在逐漸增加。在門水平上，厚壁菌門（

Firmicutes

）占絕對優勢，PSF1～PSF4組（（99.61±0.55）%）平均的

Firmicutes

相對豐度比HS組（（81.90±3.33）%）更高（圖2A）。在屬水平上，與HS組相比，PSF1～PSF4組中的優勢原核菌屬由HS組的Lactobacillus（（62.84±1.38）%）轉變為潛在己酸菌屬

Caproiciproducens

Clostridium_sensu_stricto

_12、

Clostridium_sensu_stricto

Haloimpatiens

Ligibactobacillus

（圖2B）。其中

Caproiciproducens

的相對豐度含量最高，且隨著連續培養次數增加逐漸上升（（45.90±0.30）%～（57.18±1.27）%）。

Clostridium_sensu_stricto

_12與丁酸的生成具有較強相關性，為潛在的丁酸生成菌（以下簡稱丁酸菌），其在培養液中相對豐度趨于穩定（（7.64±2.37）%），兩者均存在于濃香型白酒窖泥和黃水發酵體系中。此外，歸屬于

Lactobacillus

Ligibactobacillus

Haloimpatiens

均存在于窖泥中。黃水中的絕對優勢菌屬

Lactobacillus

更適宜在偏酸性條件下生長代謝；經過“窖泥-黃水微發酵體系”連續富集，更適宜在偏中性條 件生長代謝的

Caproiciproducens

得到更多富集，與Zhu Xiaoyu等的研究結果基本一致，同時與Wang Huilin等使用葡萄糖或葡萄糖與乙醇兩者作為碳源連續富集得到菌液的組成規律類似。此外，菌液在“窖泥-黃水微發酵體系”連續富集過 程中，反映菌液菌群豐富度的Chao1指數呈逐漸上升趨勢（圖2C），而菌群多樣性Simpson指數無顯著變化（圖2D），表明菌液在連續培養過程中菌群物種種類基本穩定，其豐度逐漸提高，與圖2B結果相印證。結果表明“窖泥-黃水微發酵體系”為以潛在己酸菌

Caproiciproducens

為主的菌群生長提供了適宜的生長條件。

3 “黃水微發酵體系”連續厭氧培養后原核菌群結構組成及其

多樣性

通過對“黃水微發酵體系”連續培養的HSF1～HSF4樣本進行16S rRNA V4區擴增子高通量測序，共獲得472 044 條優質序列，抽平后45 505 條序列/樣本。4 個連續培養菌群樣本的測序覆蓋率均大于99.99%，表明測序結果可以反映其原核菌群結構。4 個樣本中的ASV數目依次減少（29.00±2.83～14.50±0.71），表明“黃水微發酵體系”連續培養過程中菌液的原核菌群種類在逐漸減少。在門水平上，

Firmicutes

占絕對優勢，HSF1～HSF4組（（99.93±0.06）%）平均的

Firmicutes

相對豐度比HS組（（81.90±3.33）%）更高（圖3A）。在屬水平上，潛在丁酸菌

Clostridium_sensu_stricto

_12占絕對優勢，由HSF1中的（78.87±10.72）%，上升為HSF2～HSF4中的（96.17±2.90）%（圖3B），表明潛在丁酸菌

Clostridium_sensu_stricto

_12在“黃水微發酵體系”中經連續培養后占絕對優勢。同時，菌液菌群的Chao1指數逐漸下降（圖3C），Simpson指數基本無顯著變化（圖3D），表明菌液連續培養過程中的菌群物種種類基本穩定，其豐度逐漸提高，與圖3B的結果相印證，推測“黃水微發酵體系”為

Clostridium_sensu_stricto

_12的生長提供了適宜的生長條件。

4 原核菌群結構的PCA

使用基于ASV列表相對豐度的PCA評估各樣本原核菌群結構的相似性，結果如圖4所示。基于特征值的2 個PC方差貢獻率分別為77.16%和20.46%，累計方差貢獻率接近于100%，表明PCA結果非常接近于各樣本原核菌群結構之間的差異或者相似性。經過“窖泥-黃水微發酵體系”和“黃水微發酵體系”連續培養的菌液原核菌群分別聚類在一起，均與連續培養之前的黃水原核菌群結構差異較大，隨著連續發酵次數的增加，相似度越來越高，表明2 種發酵體系的連續培養有利于原核菌群結構的逐漸穩定，富集培養出適應各自培養條件的特征性菌群結構。

5 連續培養菌液原核菌群結構的理化參數變化規律

如圖5所示，“窖泥-黃水微發酵體系”和“黃水微發酵體系”富集的菌液均可降解培養基中的乳酸、乙醇和葡萄糖3 種碳源，其中降解乳酸和葡萄糖的比例相對較高，降解乙醇的比例相對較低。與“窖泥-黃水微發酵體系”相比，“黃水微發酵體系”富集的菌液降解乳酸和乙醇的水平較高，且隨著富集次數的增加而逐漸增加（圖5A、B）。“窖泥-黃水微發酵體系”富集菌液降解葡萄糖的水平較高，“黃水微發酵體系”富集菌液降解葡萄糖的水平偏低且呈逐漸增加趨勢，在第4次富集培養時與“窖泥-黃水微發酵體系”的降解葡萄糖水平接近（圖5C）。結果表明2 種發酵體系富集的菌群對碳源的降解偏好性稍有不同。“窖泥-黃水微發酵體系”對3 種碳源的降解順序依次為葡萄糖、乳酸和乙醇；“黃水微發酵體系”對3 種碳源的降解順序依次為乳酸、葡萄糖和乙醇。2 種發酵體系均對乙醇具有較低的降解水平，有利于保證實際濃香型白酒發酵過程中的白酒產量。兩者較大的差異表現在對葡萄糖和乳酸的偏好性上。

由圖6A可知，隨著連續培養次數的增加，“黃水微發酵體系”菌液代謝導致pH值增加幅度更大。推測可能與“黃水微發酵體系”中菌液的乳酸降解能力更強有關，乳酸的降解有利于pH值的增加。由圖6B～D可知，“窖泥-黃水微發酵體系”富集的菌群主要在葡萄糖存在的條件下降解葡萄糖生成少量的丁酸和較多的己酸，而且隨著富集次數的增加，己酸產量逐漸增加（0.22～2.75 g/L），接近于Wang Huilin等通過以葡萄糖為碳源的mCGM合成培養基2 次連續富集菌群的己酸生成水平；“黃水微發酵體系”富集的菌群主要降解乳酸生成較多丁酸和少量的己酸，其降解乙酸（（0.59±0.03）～（0.96±0.02）g/L）和生成丁酸（（1.34±0.06）～（2.25±0.05）g/L）的水平均隨著富集次數的增加而增加，其丁酸生成水平接近于Tao Yong等分離的丁酸菌株

Clostridium

sp. BPY5在純培養條件下的丁酸生成水平。兩種體系在己酸合成代謝中表現出的巨大差異，推測與其中富集的優勢菌屬代謝功能存在巨大差異有關，“窖泥-黃水微發酵體系”富集的

Caproiciproducens

占絕對優勢（圖2B），其“增己”功能較強；而“黃水微發酵體系”富集的

Clostridium_sensu_stricto

_12占絕對優勢（圖3B），其“增丁”功能較強。丁酸、己酸及兩者分別與乙醇酯化形成的丁酸乙酯和己酸乙酯為濃香型白酒特征性風味成分中重要的酸和酯。兩者在葡萄糖存在情況下均表現出較強的降解乳酸能力。綜上，“窖泥-黃水微發酵體系”連續富集的潛在己酸菌具有較強的“增己降乳”代謝功能，在實際生產過程中，靠近池底窖泥-黃水微發酵體系的酒醅發酵品質更好，而遠離窖泥-黃水發酵體系的酒醅中丁酸含量可能會更高。此外，本研究所使用的“窖泥-黃水微發酵體系”和“黃水微發酵體系”連續富集模式能夠靶向性富集己酸菌和丁酸菌混合菌群，為靶向性富集濃香型白酒發酵的功能菌群提供參考，其產物中長鏈脂肪酸及其衍生物可以開發成抗菌劑、飼料添加劑、食品添加劑，在醫學治療、代謝調控、環保等領域具有重要應用價值。

6 連續培養菌液中的優勢菌屬分析

使用從濃香型白酒發酵體系所分離

Caproicibacterium

的16S rRNA V4區序列對潛在己酸菌屬

Caproiciproducens

中的ASV序列進行NCBI BLASTn二次注釋，進一步分析2 種發酵體系連續培養后的菌液中潛在優勢菌種。如圖7A所示，隨著對“窖泥-黃水微發酵體系”進行連續培養，潛在己酸菌屬

Caproiciproducens

呈逐漸增加趨勢（（45.90±0.30）%～（57.18±1.27）%），表明

Caproiciproducens

逐漸得到富集。隨著

Caproiciproducens

的逐漸富集，

Caproicibacterium

相對豐度（（26.35±1.73）%～（37.66±0.59）%）逐漸遞增，其優勢ASV與菌株

C. lactatifermentans

LBM19010呈100%相似，其相對豐度基本穩定。同時，在“窖泥-黃水微發酵體系”富集的己酸菌液中，潛在丁酸菌屬

Clostridium_sensu_stricto

_12的相對豐度呈穩定趨勢，其優勢ASV與丁酸菌

C. tyrobutyricum

ATCC 25755呈100%相似，其相對豐度含量穩定且較低。以上結果表明，在“窖泥-黃水微發酵體系”中，己酸菌屬占絕對優勢，而丁酸菌屬的相對豐度很低，同時其中蘊藏著未知己酸菌與丁酸菌資源。推測，己酸菌與丁酸菌在“窖泥-黃水微發酵體系”可能存在潛在協同代謝關系，后續有待進一步研究。上述結果直接證明窖泥是己酸菌的持續釋放源，與Wang Xueshan等的研究結果一致。如圖7B所示，在“黃水微發酵體系”中潛在丁酸菌屬

Clostridium_sensu_stricto

_12占絕對優勢，其相對豐度（（78.87±0.72）%～（98.38±0.18）%）隨著富集培養次數的增加而增加，然后逐漸趨于穩定。其中的優勢ASV與“窖泥-黃水微發酵體系”中的

C. tyrobutyricum

ATCC 25755相同。而在“黃水微發酵體系”中，潛在己酸菌屬

Caproiciproducens

的相對豐度甚微，其中優勢ASV與已知己酸菌

C. argilliputei

ZCY20-5呈100%相似。由此推測，在沒有窖泥提供持續菌種緩釋的情況下，丁酸菌比己酸菌相對更具有生長優勢。

7 連續培養菌液中原核菌群結構與理化參數的RDA

由圖8A可知，2 個坐標可解釋原核菌群結構96.58%的變化，2 個坐標軸的相關性分別高達99.30%和91.10%，表明菌群結構與理化參數變化值之間具有較強的相關性。乙酸（85.50%）、葡萄糖（8.30%）、己酸（4.20%）、丁酸（0.70%）、乳酸（0.50%）、乙醇（0.50%）和pH值（0.20%）等理化參數變化量對菌液原核菌群結構的貢獻依次降低。其中，乙酸、葡萄糖、己酸、丁酸變化量具有顯著貢獻。推測乙酸作為己酸或者丁酸合成的共同底物，其消耗對兩組代謝體系菌群的生長具有重大貢獻。2 種發酵體系連續培養后菌液原核菌群結構主要在坐標軸1上差異聚類，乙酸、乳酸、丁酸、乙醇和pH值的變化與“黃水微發酵體系”連續培養菌液呈正相關，表明以上參數的變化與其原核菌群結構的定向富集具有較強相關性。己酸和葡萄糖的變化與“窖泥-黃水微發酵體系”連續培養呈正相關，表明底物己酸和葡萄糖的代謝與其原核菌群結構的定向富集具有較強相關性，與2.5節的結論相印證。如圖8B所示，菌群結構與碳源和己酸合成相關產物等的RDA結果表明2 個坐標軸可解釋原核菌群結構97.28%的變化，并且2 個坐標軸的相關性高達99.82%和86.29%，表明菌液的菌群結構與其發酵后理化參數之間具有較強相關性。培養后菌液的丁酸（96.3%）、葡萄糖（2.00%）、己酸（1.00%）、乳酸（0.20%）、乙酸（0.20%）、乙醇（0.20%）和pH值（0.10%）等理化參數對菌群結構的貢獻度依次降低，其中丁酸、葡萄糖和己酸對菌液菌群結構具有顯著貢獻。推測丁酸作為己酸或者丁酸合成的共同產物，其合成對2 組發酵體系菌群的生長具有最大貢獻，其余理化參數對菌群結構的影響有待將來進一步研究。2 種發酵體系連續培養后菌液原核菌群結構主要在坐標軸1上差異聚類，發酵后乙酸、乳酸、乙醇的含量與“窖泥-黃水微發酵體系”連續培養菌液的菌群結構呈正相關，發酵后丁酸和葡萄糖的含量與“黃水微發酵體系”連續培養后菌液原核菌群結構呈正相關。

8 連續培養菌液中原核菌群己酸合成代謝功能預測分析

進一步通過Picrust2工具對2 種發酵體系連續培養后菌液原核菌群分別進行底物代謝和通過RBO、FAB代謝途徑進行己酸合成代謝的功能進行預測分析。

如圖9A所示，通過“窖泥-黃水微發酵體系”富集的菌群參與乙酸和乙酰輔酶A代謝的乙醛脫氫酶、磷酸轉乙酰酶和乙酸激酶水平較高（聚類1）；通過“黃水微發酵體系”富集的菌群參與丙酮酸、乳酸和乙醇底物降解的丙酮酸脫氫酶、乳酸脫氫酶和乙醇脫氫酶水平較高（聚類2）。表明“黃水微發酵體系”富集的菌群降解乳酸和乙醇的能力更強，與2.5節的結果相印證。

如圖9B所示，通過“窖泥-黃水微發酵體系”富集的菌群參與電子傳遞、合成丁酸和己酸代謝的鐵氧還蛋白氫化酶、丁酰輔酶A（乙酸輔酶A轉移酶、磷酸丁酰轉移酶、丁酸激酶和酰基輔酶A硫酯酶）水平均較高（聚類3），表明“窖泥-黃水微發酵體系”富集的菌群具有持續合成中間產物丁酸并進一步合成己酸的能力，其預測較強的己酸合成能力與2.5節實際檢測到較高的己酸合成水平相印證。然而，通過“黃水微發酵體系”富集的菌群參與合成乙酸→丁酸和丁酸→己酸中間產物代謝的酮酰基輔酶A還原酶（3-羥酰基輔酶A脫氫酶、3-羥基丁酰輔酶A脫氫酶）、短鏈酰基-CoA脫氫酶、乙酰乙酰輔酶A硫解酶和3-羥基丁酰輔酶A脫水酶水平較高（聚類4），推測“黃水微發酵體系”富集的菌群可能缺乏進行己酸合成完整代謝鏈所需要的酶，進而不利于合成己酸。“窖泥-黃水微發酵體系”連續富集的潛在己酸菌與“黃水微發酵體系”連續富集的潛在丁酸菌均可通過RBO碳鏈延長反應生成己酸或者丁酸，因此在濃香型白酒發酵體系中丁酸菌與己酸菌之間是否有潛在協同代謝作用有待進一步研究。

如圖9C所示，通過“窖泥-黃水微發酵體系”富集的菌群參與合成丁酰基-

-酮酰基-ACP、己酰基-

-酮酰基-ACP、丁酰基-

-羥脂酰-ACP、己酰基-

-羥脂酰-ACP、丁酸和己酸代謝的酰基輔酶A硫酯酶、

-酮酰基-酰基載體蛋白合成酶I、

-酮酰基-酰基載體蛋白合成酶II、磷酸丁酰轉移酶、丁酸激酶、

-酮酰基-ACP還原酶和3-羥基脂酰ACP脫水酶水平較高（聚類5）；通過“黃水微發酵體系”富集的菌群參與丁酸和己酸合成過程中的中間產物丁酮酰基-ACP、己酮酰基-ACP、丁酰基-

-酮酰基-ACP、己酰基-

-酮酰基-ACP代謝的烯醇基ACP還原酶、丙二酰轉移酶、

-酮酰基-酰基載體蛋白合成酶III、乙酰輔酶A羧化酶水平較高（聚類6）。由上述結果推測在連續培養的菌液中可能同時存在己酸合成的RBO和FAB代謝通路，這與Zhu Xiaoyu和Zhao Wenyan等對具有己酸合成功能菌群的代謝通路分析結果一致。

9 “窖泥-黃水微發酵體系”和“黃水微發酵體系”連續培養菌液中乳酸降解功能菌群分析

基于上述分析可知，“黃水微發酵體系”富集丁酸菌降解乳酸的能力更強，“窖泥-黃水微發酵體系”富集己酸菌合成代謝己酸的能力更強。因此，濃香型白酒發酵體系中起降解乳酸作用的菌主要是丁酸菌。為證明該結論，分別將PSF4與HSF4菌液接種到以乳酸為唯一碳源的選擇培養基中培養3 d，分別形成PSS和HSS菌液，其優勢原核菌屬均為潛在丁酸菌屬

Clostridium_sensu_stricto

_12（（83.92±8.49）%、（90.09±5.42）%），同時包含一定豐度的

Staphylococcus

Sporolactobacillus

（圖10A）。與PSS菌液相比，HSS菌液降解乳酸的能力更強，能夠生成更多的丁酸。PSS菌液中己酸菌屬的相對豐度消失殆盡，而潛在丁酸菌屬的相對豐度大幅度增加；PSS菌液仍可大量降解乳酸，而合成己酸的水平雖然比HSS菌液稍多，但與PSF菌液相比，其己酸合成水平顯著降低（圖6D和圖10B）。推測

Caproiciproducens

的生長代謝需要葡萄糖，在葡萄糖存在的情況下，

Caproiciproducens

可以降解乳酸產生己酸，而乳酸作為唯一碳源則會影響

Caproiciproducens

的生長。這與Wang Huilin等研究發現窖泥中優勢菌株

C. lactatifermentans

LBM19010的代謝特征一致。在實際濃香型白酒發酵過程中，葡萄糖是淀粉糊化、進一步糖化后的主要產物，同時作為后續發酵形成乙醇的主要底物，其在黃水形成的濃香型白酒發酵后期含量很少，而且其作為包括己酸菌在內很多厭氧菌代謝的速效碳源迅速減少。以乳酸作為唯一碳源的丁酸菌對于己酸菌是一種補充，推測兩者在“降乳”功能上相互協同，而“增己”功能則主要由己酸菌實現。因此，在實際濃香型白酒發酵過程中為保證己酸菌的己酸合成代謝，需要一定的殘糖留存。對PSS和HSS原核菌群結構進行PCA可知，兩者的菌群結構聚類相近（圖10C），與兩者菌群結構分析結果相印證。

結論

本實驗通過“窖泥-黃水微發酵體系”和“黃水微發酵體系”進行連續4 輪富集培養，分別研究了有窖泥和無窖泥情況下對黃水原核菌群結構、底物降解和己酸合成相關理化參數以及富集優勢功能菌的影響。“窖泥-黃水微發酵體系”富集的菌群中潛在己酸菌屬

Caproiciproducens

占絕對優勢，伴隨部分潛在丁酸菌屬

Clostridium_sensu_stricto

_12，其主要在存在葡萄糖的情況下降解乳酸，并以乙酸為電子受體生成少量的丁酸和較多己酸。即在存在葡萄糖的情況下，“窖泥-黃水微發酵體系”富集的菌群具有“增己降乳”功能。“黃水微發酵體系”富集的菌群中潛在丁酸菌屬

Clostridium_sensu_stricto

_12占絕對優勢，主要降解乳酸生成丁酸和少量的己酸。即在存在葡萄糖的情況下，“黃水微發酵體系”富集的菌群具有“增丁降乳”功能。“窖泥-黃水微發酵體系”中的優勢己酸菌株為

C. lactatifermentans

LBM19010，“黃水微發酵體系”中的優勢丁酸菌株為

C. tyrobutyricum

ATCC 25755。通過RDA和Picrust2功能預測分析推測底物葡萄糖有利于窖泥中己酸菌在黃水連續富集過程中代謝生成己酸，底物乳酸有利于黃水中丁酸菌在連續富集過程中代謝生成丁酸。進一步通過乳酸選擇培養基證實在不存在葡萄糖的情況下己酸菌具有生長優勢，丁酸菌在菌群富集過程中起主要乳酸降解作用。結果表明，窖泥對濃香型白酒發酵過程中的己酸合成代謝具有重要作用，能夠靶向富集己酸菌和丁酸菌混合菌群。本實驗可為將來進一步研究己酸菌和丁酸菌之間的協同代謝提供理論支撐。

本文《 濃香型白酒發酵體系己酸菌液的連續富集及其“增己降乳”功能 》來源于《食品科學》2025年46卷第16期153-164 頁， 作者： 王秀本，常 強，甄 莉，崔 磊，薛正蓮，王 越，席鮮會，徐康杰，孫 偉，張會敏* 。 DOI: 10.7506/spkx1002-6630-20250104-025 。 點擊下方 閱讀原文 即可查看文章相關信息。

實習編輯：林安琪；責任編輯：張睿梅。點擊下方 閱讀原文 即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網