FSHW | 負載番茄紅素的鐵蛋白納米籠改善血腦屏障轉運并緩解神經細胞衰老和凋亡

本文系Food Science and Human Wellness原創編譯，歡迎分享，轉載請授權。

Introduction

衰老是隨著時間的推移不可避免的生理退化過程，伴隨腦功能的下降，表現為氧化應激增加、神經元丟失、神經傳導下降、記憶下降等。研究表明，活性氧（ROS）的過度產生觸發細胞內過氧化反應和級聯反應，是神經元退行性變微環境的主要驅動力。近年來，納米材料設計策略已廣泛用于退行性神經元的靶向干預。考慮到工程納米復合物的生物相容性差、腦血比低、ROS清除不足、合成困難和尺寸大等一系列問題，迫切需要一種快速且可代謝的合成策略，用于腦蓄積和有效的ROS消除。

天然抗氧化藥物在復雜發病機制的長期干預過程中可以提高患者的免疫力。其中，番茄紅素（LYC）作為高效抑制單線態氧（1O2）的類胡蘿卜素，可抑制氧化應激級聯反應、神經元凋亡、神經炎癥和線粒體損傷。然而，LYC的低生物利用度和血腦屏障的低通透性限制了其在神經元中的有效性，使合適的載體成為保護和豐富它的必要條件，以放大其在大腦中的功能。理想的納米遞送平臺應具有較高的循環穩定性，便于將載藥靶向遞送到特定部位并以優異的生物相容性被神經元吸收。與此同時，得益于納米顆粒的保護屏障和遞送，親脂性分子的水溶性和穩定性提高，使其對神經元更有效。

本研究以重組人H-鐵蛋白納米籠（rHuHF）為最佳載體構建天然抗氧化rHuHF-LYC納米粒。通過異源表達獲取rHuHF載體，將LYC分子裝入rHuHF的穩定空腔內，通過分子模擬結合實驗驗證探究rHuHF與LYC的相互作用。通過BBB跨細胞模型、亞細胞熒光定位及rHuHF-LYC的抗氧化活性驗證rHuHF-LYC的神經功能改善作用。rHuHF-LYC為腦保護和抗衰老提供了有效的策略。

Results and Discussion

rHuHF-LYC納米顆粒的構建與表征

純化的rHuHF（約480 kDa）僅由約20 kDa的一個亞單位形成（圖1C），由于LYC的大小（長33.3 ?，寬10.9 ?）遠遠超出了rHuHF表面的通道（3～4 ?），LYC被rHuHF包裹在其內部腔內并穩定存在（圖1A）。在此情況下，包封率和載藥率分別為60.64%和6.06%（圖1B），即LYC/rHuHF的平均顆粒比平均為56∶1，遠高于姜黃素、蘆丁、β-胡蘿卜素等脂溶性物質。此外，rHuHF水溶液清澈透明，rHuHF-LYC溶液呈均勻鮮紅色，游離的LYC呈固體顆粒懸浮（圖1B）。納米粒子仍然具有良好的納米籠形態和均勻的直徑（圖1D），納米籠尺寸的輕微擴展解釋了它們的尺寸靈活性，不同的是，內化的LYC顯著干擾rHuHF腔內鐵的氧化成核。因此，當對蛋白球進行透射電子顯微鏡（TEM）成像時，更多的黑乙酸鈾進入了rHuHF-LYC的腔內（圖1E）。這表明LYC分子成功插入到rHuHF腔中，并伴隨著LYC溶解度的巨大變化。包封有利于LYC分子在外界體系中的穩定，剛性rHuHF納米籠包埋后二級結構和粒徑沒有變化（圖1F和圖G），為負載的LYC分子提供物理屏障和化學穩定作用。

圖1 rHuHF-LYC納米顆粒的構建與表征

LYC與其蛋白籠的相互作用使LYC分子穩定

由于LYC的易降解性和較強的抗氧化能力在保健功能食品中廣泛應用，因此需要提高其穩定性以防止其生物學特性的喪失。剛性的rHuHF納米籠穩定了LYC分子，作為保護屏障阻擋了外部系統的影響因素，rHuHF-LYC的熱穩定性和抗氧化能力相比于游離的LYC都有很大的改善（圖2A和B）。熱降解動力學的回歸系數（R2）分別為0.9558（LYC）和0.9945（rHuHF-LYC），表明LYC的降解保留量與反應時間具有良好的相關性。當降解速度減慢時，rHuHF-LYC納米粒子中的LYC含量穩定在初始水平的85%左右，而游離LYC組在7 h時的LYC含量僅為78%，表明rHuHF的包封增強LYC的熱穩定性。此外，當反應時間超過60 min時，rHuHF-LYC組對DPPH的抑制作用顯著增強（P＜0.01），遠高于游離LYC對照組。結果表明，由于殼狀鐵蛋白納米籠的保護，LYC的抗氧化能力隨著時間的推移保持良好。結果也說明了LYC分子與其蛋白籠之間可能存在的相互作用，從而保證了LYC分子的穩定性。

通過分子對接模擬計算了LYC分子與其rHuHF納米籠之間的相互作用。高CDOCKER能量（?ECD）表明，LYC的結合位點位于四重軸通道附近的rHuHF-LYC納米籠的管腔中，由ALA47、LYS49和LYS172組成，形成疏水鍵（圖2C）。這種結合力可能促進了LYC分子成功包封到鐵蛋白納米籠中，從而導致兩者相互作用引起的LYC的穩定性和溶解度。此外，通過ITC測定了rHuHF和LYC的平衡熱變化及其參數。原始數據的擬合曲線揭示了rHuHF和LYC的結合（圖2D2）。反應的ΔH（焓）、ΔS（熵）、ΔG（未顯示）、結合常數Kd和n（表觀結合化學計量）值分別為?1826 kJ/mol、?6 002 J/（mol·K）、?37.4 kJ/mol、4.572×10?7 mol/L和1.193。ΔH和ΔS為負，表明rHuHF與LYC之間存在良好的非共價相互作用。因此，結合反應可以是非特異性的、放熱的（ΔH＜0）和自發的（ΔG＜0）結合反應。以上結果表明，將LYC包封到rHuHF納米籠中可以通過相互作用提高LYC的穩定性和溶解度。

圖2 rHuHF-LYC納米粒子的穩定性與相互作用分析

血腦屏障的胞吞作用和神經元靶向能力的評估

rHuHF通過內源性受體介導轉運發揮最佳納米載體的作用，而TfR1在血腦屏障內皮細胞中大量表達，允許rHuHF通過內體室跨血腦屏障轉移。為了驗證rHuHF-LYC納米復合物對血腦屏障的穿透，進行了血腦屏障跨細胞實驗。在確認FITC-rHuHF-LYC不影響細胞存活的基礎上，將其添加到人或小鼠血腦屏障內皮細胞的上腔（圖3A和B）。FITC-rHuHF-LYC顯著穿過人或小鼠BBB內皮細胞，而FITC-LFn（對照人L-鐵蛋白）則沒有。在1 h內，hCMEC/D3細胞幾乎是FITC-LFn的5倍（P < 0.001）（圖3C和D）。2 h后，較低的PC12細胞對FITC-rHuHF-LYC的吸收顯著增加（P < 0.001）（圖3E和圖3f）。此外，FITC-rHuHF-LYC和溶酶體的熒光共成像顯示其非共定位，Pearson相關系數分別為?0.11和0.16，表明FITC-rHuHF-LYC在BBB ECs中沒有被吸收，而是被轉運（圖3G）。這些結果表明rHuHF-LYC能夠在體外穿過血腦屏障。此外，FITC-rHuHF-LYC被PC12細胞明顯吸收并與溶酶體共定位（圖3H和J），Pearson相關系數為0.73（圖3I），說明FITC-rHuHF-LYC可以進入神經細胞。這與BBB ECs transwell的跨細胞轉運結果一致，共同證明了FITC-rHuHF-LYC可被神經細胞吸收。

圖3 rHuHF-LYC穿越血腦屏障并被神經細胞攝取

rHuHF-LYC納米顆粒作為神經元細胞內ROS清除劑的研究

在神經元微環境中，氧化損傷先于神經病理的發生，導致線粒體進一步損傷，甚至認知功能下降。一些研究強調了基于D-半乳糖（D-gal）的誘導腦衰老和神經元凋亡模型。在此，培養BV2和PC12細胞，研究rHuHF-LYC對D-gal誘導損傷的過氧化緩解作用。500 mmol/L D-gal可使BV2和PC12細胞達到IC50，加入rHuHF-LYC以劑量依賴性方式顯著降低PC12細胞中的ROS水平（P＜0.05），這優于單獨加入rHuHF（圖4A）。此外，在PC12細胞中驗證了rHuHF-LYC對細胞內SOD活性的調節（圖4B），20 μg/mL及以上的rHuHF-LYC顯著減弱了D-gal誘導的SOD活性下降（P＜0.05）。同樣，D-gal誘導的PC12和BV2細胞的強ROS信號減弱，rHuHF-LYC處理后逐漸接近對照組的熒光強度（圖4C、E、F），也減輕了BV2和PC12細胞的形態皺縮和凋亡傾向（圖4D）。這些結果表明，rHuHF-LYC納米粒子減弱了D-gal誘導的細胞過氧化反應。

圖4 rHuHF-LYC對D-gal誘導的BV2和PC12細胞損傷的保護作用

此外，rHuHF-LYC顯著減輕了BV2和PC12細胞的凋亡，表現為線粒體膜電位和磷脂酰絲氨酸外翻的變化（圖5A）。熒光成像和定量分析顯示，rHuHF-LYC的加入有利于維持完整的細胞形態（粉色和藍色），減少碎片或凋亡（綠色），維持細胞黏附。rHuHF-LYC以劑量依賴性方式顯著抑制凋亡PC12細胞的數量（圖5B）。因此，在D-gal干擾下，BV2細胞對神經元的營養和保護作用減弱，而rHuHF-LYC在修復這些不良變化的同時，起到了直接保護神經元的作用。乙酰膽堿酯酶（AChE）和乙酰膽堿酯酶（ACh）是膽堿能系統的關鍵物質，在評價神經細胞狀態方面具有重要作用。rHuHF-LYC顯著抑制了D-gal損傷后BV2和PC12細胞中AChE活性的增加和ACh活性的降低（P＜0.05），減輕了D-gal誘導的神經細胞興奮性降低或終止（圖5C和D）。這些結果表明，納米粒子通過維持抗氧化防御和線粒體功能在保護BV2和PC12細胞中發揮了至關重要的作用。

圖5 通過rHuHF-LYC治療減輕線粒體膜電位丟失和神經元凋亡

通過rHuHF-LYC調控PC12細胞凋亡相關蛋白的表達

通過蛋白質印跡法檢測特征性的促/抗凋亡和衰老相關蛋白（圖6），免疫印跡結果顯示，與模型組相比，rHuHF-LYC納米粒顯著上調Bcl-xL和Bcl-2的表達（P＜0.05），下調p-AKT、Bad、Bax、cleaved caspase-3和p53的表達（P＜0.05）。rHuHF-LYC處理PC12細胞后，下調p-AKT水平引起線粒體介導的Bcl-xL/Bad值升高和Bax/Bcl-2降低。最后，rHuHF-LYC可顯著下調cleaved caspase-3和p53的表達（P＜0.05），從而抑制神經細胞凋亡。rHuHF-LYC通過調控細胞內凋亡相關蛋白的表達水平，減緩PC12細胞的神經元凋亡。

圖6 Western blot分析rHuHF-LYC對PC12細胞神經元凋亡相關蛋白表達水平的影響

Conclusion

綜上所述，具有清除神經活性氧能力的rHuHF-LYC納米粒通過保護神經元和改善神經微環境表現出優異的性能。rHuHF-LYC通過受體介導的內吞途徑穿過血腦屏障并內化到神經元內。隨后，PC12和BV2細胞的過度氧化和線粒體穩態失衡得到緩解。此外，rHuHF-LYC通過調節細胞內凋亡相關蛋白的表達水平，減緩PC12細胞的神經元凋亡。因此，rHuHF-LYC納米顆粒抑制了不良神經微環境的發展，為對抗大腦衰老提供了一種有前景的治療選擇。

第一作者

夏小雨，女，工學博士，現為廣東海洋大學食品科技學院講師。研究方向為貝類蛋白構效關系及功能機制、靶向型生物納米材料的功能營養精準遞送。曾獲博士國家獎學金、2024屆遼寧省優秀博士畢業生、大連工業大學優秀博士學位論文。參與貝類產業技術體系項目、國家自然科學基金、湛江市科技計劃等多個項目，以第一作者在ACS Nano、FSHW和JAFC等期刊發表論文9篇，參編著作1部，獲授權發明專利3件。

通信作者

杜明，教授，大連海洋大學校長，博士研究生導師，大連工業大學食品學院/國家海洋食品工程技術研究中心朱蓓薇院士團隊“蛋白質科學與技術”研究方向負責人。入選國家萬人計劃科技創新領軍人才、科技部中青年科技創新領軍人才、教育部新世紀優秀人才。兼任國務院食品與營養專業學位研究生教育指導委員會委員、遼寧省食品科學技術學會副理事長；學術兼職包括Food Frontiers、Food Science and Human Wellness、Protein and Peptide Letters、《食品科學》、《食品工業科技》、《食品工研究與開發》、《大連工業大學學報》等期刊編委。主要從事研究領域：（1）食源性蛋白構效關系及活性機制；（2）專用功能性蛋白質配料加工技術；（3）民族特色食品加工及產業化。主持國家十四五重點研發專項項目、國家十三五重點研發專項項目、國家自然科學基金重點項目等多項課題。作為主要完成人獲省部級科技進步一等獎和二等獎各2項，省部級科技發明二等獎1項，國家教學成果二等獎1項。在Nature Communications、ACS nano、Chemical Engineering Journal等期刊以第一或通訊身份發表論文170余篇，論文總引用次數6400余次，H-index 43；參編《Mineral Containing Proteins》，《Biologically Active Peptides》等著作13部；制定“蛋白質基食品”相關行業標準3項，第一發明人授權國家發明19項。

Ferritin nanocage loading lycopene for improving blood-brain barrier transcytosis and attenuating D-galactose-induced apoptosis in PC12 cells

Xiaoyu Xiaa,b,c, Han Lia,b,c, Xianbing Xua,b,c, Zhenyu Wanga,b,c, Junjie Yid, Guanghua Zhaoe, Ming Dua,b,c,*

a School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China

b Collaborative Innovation Centre of Provincial and Ministerial Co-construction for Seafood Deep Processing, Dalian 116034, China

c National Engineering Research Centre of Seafood, Dalian 116034, China

d Faculty of Food Science and Engineering, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500, China

e College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China

*Corresponding author.

Abstract

Aging is a physiological process that leads to degeneration and functional decline of the brain. This is accompanied by intracellular peroxidation and neuronal apoptosis. Natural antioxidants possess a remarkable effect on attenuating the oxidative stress cascade and apoptosis of neurons; however, the challenge of using natural antioxidants for neuroprotection is fabricating a delivery system to overcome the blood-brain barrier (BBB) transport. Herein, we successfully created a stable delivery platform built on rigid ferritin nanocage loading natural lycopene molecules, crossing the BBB in quantity and being taken up in neurons. This nanoparticle worked on D-galactose-induced senescence via alleviating neuronal hyperoxidation injury and weakening neuronal apoptosis in PC12 and BV2 cells. More importantly, this natural delivery system possesses inherent biocompatibility and potential application in improving the bioavailability of bioactive edible compounds with low water solubility. This study demonstrated the effectiveness of natural antioxidant nanomedicines in maintaining the defenses of intracerebral peroxidation and improve degenerating neurons, providing the potential to combat further imbalances of neuronal microenvironment in aging neuropathy.

Reference:

XIA X Y, LI H, XU X B, et al. Ferritin nanocage loading lycopene for improving blood-brain barrier transcytosis and attenuating

D

本文編譯內容由作者提供

編輯：梁安琪；責任編輯：孫勇

封面圖片：圖蟲創意