《食品科學(xué)》：山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院李非凡博士等：B-大麥醇溶蛋白的分離優(yōu)化與黏附效果

大麥醇溶蛋白是一種典型的疏水型蛋白，具有優(yōu)良的表面特性、生物可降解性、生物相容性和抗氧化性。根據(jù)其分子質(zhì)量大小與氨基酸組成等方面的差異，可將大麥醇溶蛋白分為B-hordein、C-hordein、A-hordein與D-hordein共4 類。B-hordein分子質(zhì)量為30～50 kDa，是大麥醇溶蛋白的主要組分，約占總醇溶蛋白的70%；C-hordein的分子質(zhì)量為50～80 kDa，占總大麥醇溶蛋白的10%～20%，是大麥醇溶蛋白中的第二大組分大麥醇溶蛋白具有較強(qiáng)的成膜性等天然活性。研究發(fā)現(xiàn)，基于大麥醇溶蛋白的納米顆粒在模擬胃消化中能夠較好地抵抗胃消化。

復(fù)凝聚反應(yīng)是指當(dāng)兩種帶相反電荷的聚電解質(zhì)在溶液中共存時(shí)通過(guò)靜電吸引而發(fā)生相分離產(chǎn)生沉淀的過(guò)程。目前，在食品領(lǐng)域研究較多的復(fù)凝聚體系為蛋白質(zhì)/多糖復(fù)凝聚體系與多糖/多糖復(fù)凝聚體系。其中，對(duì)蛋白質(zhì)/多糖復(fù)凝聚體系的研究較多，在該體系下形成的復(fù)凝聚物具有良好的膠凝能力與乳化能力，因此，蛋白質(zhì)/多糖復(fù)凝聚體系在食品領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與多糖發(fā)生復(fù)凝聚反應(yīng)時(shí)，一部分蛋白質(zhì)組分優(yōu)先與帶相反電荷的多糖結(jié)合，發(fā)生相分離并形成復(fù)凝聚物，而另一部分蛋白組分因帶電性、空間結(jié)構(gòu)等因素而不與多糖結(jié)合，離心后，結(jié)合蛋白質(zhì)進(jìn)入沉淀而未結(jié)合保留在上清液中。這種現(xiàn)象被稱為選擇性復(fù)凝聚，通過(guò)這一反應(yīng)可實(shí)現(xiàn)不同大分子組分的分離。

本課題組曾研究了大麥醇溶蛋白與ι-卡拉膠（Car）的選擇性結(jié)合，利用這種選擇性結(jié)合行為，可獲得B-hordein/Car復(fù)凝聚物與僅含有C-hordein的上清液，理論上，初步實(shí)現(xiàn)了C-hordein與B-hordein的分離。然而，通過(guò)調(diào)節(jié)pH值（堿溶）無(wú)法將全部的B-hordein與Car有效分離，這導(dǎo)致B-hordein的回收率過(guò)低（＜50%）。考慮到果膠是一種富含半乳糖醛酸的羧基類多糖，分散在水溶液中主要帶負(fù)電，具備發(fā)生復(fù)凝聚反應(yīng)的條件，因此，采用低酯果膠（LMP）與高酯果膠（HMP）作為本研究的主要材料。

山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院的李非凡*、遲曉君、秦洋等擬檢驗(yàn)大麥醇溶蛋白與兩種果膠的選擇性結(jié)合情況，分析蛋白質(zhì)的組分分離效果，通過(guò)制備蛋白組分與CS的復(fù)合物，表征不同蛋白組分在構(gòu)建黏膜吸附遞送系統(tǒng)中的作用效果。本研究通過(guò)檢驗(yàn)選擇性結(jié)合行為在組分分離中的可行性，以期為開發(fā)規(guī)模化分離蛋白組分的新方法提供技術(shù)支持，同時(shí)為構(gòu)建基于生物大分子的黏膜吸附型遞送載體提供理論參考。

01

大麥醇溶蛋白的提取與鑒定結(jié)果

經(jīng)Osborne法提取的大麥醇溶蛋白的分子質(zhì)量分布如圖1所示，分子質(zhì)量30～50、55～80 kDa的條帶清晰可見，分別對(duì)應(yīng)B-hordein與C-hordein，二者均為大麥醇溶蛋白的主要組分；而＞85、＜15 kDa的條帶較淺，分別對(duì)應(yīng)D-hordein與A-hordein，說(shuō)明二者的含量相對(duì)較低，這與Mohamed和Shewry等的報(bào)道一致，他們的研究結(jié)果均表明B-hordein和C-hordein是大麥醇溶蛋白的主要組分，分別占總蛋白的70%～80%和10%～20%；A、D組分的總和不足總蛋白的5%。上述結(jié)果表明，利用Osborne法可有效提取大麥醇溶蛋白。

02

混合體系的Zeta電位

通過(guò)表征大麥醇溶蛋白與兩種果膠在pH 11.0～3.0范圍內(nèi)的Zeta電位，判斷是否可能發(fā)生復(fù)凝聚反應(yīng)。如圖2所示，滴定前蛋白帶負(fù)電，隨著pH值的降低，電位絕對(duì)值逐漸降低，當(dāng)pH值達(dá)6.6時(shí)，蛋白的電位值接近0，表明大麥醇溶蛋白的pI≈6.6，這與已有報(bào)道相符。進(jìn)一步降低pH值，蛋白帶正電，電位隨pH值的降低而增大。以上結(jié)果表明，在pH 11.0～3.0范圍內(nèi)，隨著pH值的降低，大麥醇溶蛋白可實(shí)現(xiàn)由負(fù)電位向正電位的轉(zhuǎn)變，在此基礎(chǔ)上，蛋白與果膠可通過(guò)靜電引力相互結(jié)合。

HMP與LMP均為羧酸類多糖，如圖2、3所示，當(dāng)分散液的pH值由11.0降低至3.0時(shí)，HMP的電位值由-12.2 mV增大至-0.7 mV，LMP的電位值由-14.3 mV增大至-2.4 mV。與HMP相比，LMP的電位絕對(duì)值較大，這可能是由于LMP的酯化度較低，羧基基團(tuán)的占比較高，從而導(dǎo)致其電位絕對(duì)值較高。除此之外，pH值為11.0時(shí)，Hordein/HMP與Hordein/LMP混合體系均帶負(fù)電，對(duì)于Hordein/HMP混合體系（圖2），當(dāng)?shù)鞍?果膠比例為1∶1～10∶1時(shí)，混合體系在pH 6.0～7.0左右實(shí)現(xiàn)電中和（Zeta電位由負(fù)電位開始轉(zhuǎn)變?yōu)檎娢唬@證明了復(fù)凝聚反應(yīng)的發(fā)生。此外，在Hordein/LMP混合體系中（圖3）也觀察到了類似結(jié)果。上述結(jié)果說(shuō)明，Hordein/HMP與Hordein/LMP混合體系均可發(fā)生復(fù)凝聚反應(yīng)。

03

混合體系的濁度

通過(guò)濁度滴定實(shí)驗(yàn)記錄復(fù)凝聚反應(yīng)過(guò)程中pHc、pHφ、pHmax與最大濁度值，研究大麥醇溶蛋白與HMP、LMP的復(fù)凝聚行為。如圖4所示，對(duì)于大麥醇溶蛋白，當(dāng)pH值由11.0逐漸降低至7.4時(shí)，其濁度值基本保持不變；當(dāng)pH值由7.4繼續(xù)降低時(shí)，蛋白濁度迅速增大，并在pH 6.6時(shí)達(dá)最大值，這是由于體系pH值接近蛋白等電點(diǎn)，進(jìn)而導(dǎo)致了蛋白的絮凝。繼續(xù)降低pH值，濁度迅速降低，直至與初始濁度值相同。

在pH 11.0～3.0范圍內(nèi)，HMP（圖4）與LMP（圖5）的濁度值未發(fā)生明顯變化。對(duì)于Hordein/HMP、Hordein/LMP復(fù)合物，在pH 11.0～3.0范圍內(nèi)，可觀察到復(fù)合物的pHc、pHφ、pHmax。其中，pHc表示可溶性復(fù)合物的形成，對(duì)于Hordein/HMP混合體系，其pHc由10.0（Hordein/HMP10∶1）逐漸降低至7.2（Hordein/HMP1∶1），在Hordein/LMP混合體系中也可以觀察到類似結(jié)果。數(shù)值上，復(fù)合物的pHc均大于單一蛋白的pI，這可能是由于在特定pH值下，大麥醇溶蛋白表面存在局部正電荷補(bǔ)丁，促進(jìn)了蛋白與陰離子多糖的結(jié)合。同時(shí)，除靜電引力外，還存在氫鍵作用等其他非共價(jià)作用，共同促進(jìn)了復(fù)合物的形成。

pHφ表示不溶性復(fù)合物的形成，當(dāng)pH值降低至pHφ時(shí)，體系的濁度值快速升高，這是由于復(fù)合物表面電荷降低，靜電斥力進(jìn)一步減小。pHmax為濁度值最大時(shí)的pH值，pHmax表示復(fù)合物中帶有正、負(fù)電荷的聚合物實(shí)現(xiàn)了電中和，復(fù)合物表面電荷為零，此時(shí)靜電斥力最小，發(fā)生相分離，導(dǎo)致濁度進(jìn)一步增大。本實(shí)驗(yàn)中，隨著蛋白比例的減少，Hordein/HMP與Hordein/LMP混合體系的pHmax逐漸降低，這是由于蛋白比例的減少使混合體系中帶正電基團(tuán)的比例減小，因此，需要在蛋白正電位絕對(duì)值較高，即混合體系pH值較低時(shí)，才能實(shí)現(xiàn)電中和，這與已有報(bào)道相符。

當(dāng)pH值降低至pHmax時(shí)，Hordein/HMP與Hordein/LMP混合體系均出現(xiàn)最大濁度值。值得一提的是，大麥醇溶蛋白達(dá)pI時(shí)的濁度值約0.54，遠(yuǎn)大于蛋白/果膠混合體系的最大濁度值0.24（Hordein/HMP10∶1，pH 7.4），并且，蛋白/果膠體系的最大濁度值隨果膠比例的增大而減小，這可能是由于增大果膠的比例進(jìn)一步改善了大麥醇溶蛋白的分散性。達(dá)pHmax后，繼續(xù)降低pH值使蛋白/果膠體系的濁度值持續(xù)降低，直至與初始值相同，這可能是由于羧基類多糖與蛋白的結(jié)合能力較弱，pH值的降低使二者之間的靜電斥力增大，導(dǎo)致了二者的分離。由此推測(cè)，調(diào)節(jié)pH值可以使果膠與其結(jié)合的蛋白組分良好地分離。

04

選擇性結(jié)合情況分析

通過(guò)SDS-PAGE分析大麥醇溶蛋白主要組分與HMP、LMP的選擇性結(jié)合，評(píng)估通過(guò)復(fù)凝聚反應(yīng)分離蛋白組分的可行性。如圖6所示，大麥醇溶蛋白（泳道H）的條帶清晰可見，其中，分子質(zhì)量分布在30～50、55～80 kDa的條帶分別為B-hordein與C-hordein。復(fù)凝聚物的電泳結(jié)果表明，在質(zhì)量比1∶1～10∶1時(shí)，Hordein/LMP與Hordein/HMP的復(fù)凝聚物中均僅含有B-hordein而不含C-hordein，說(shuō)明B-hordein具有優(yōu)先與LMP、HMP結(jié)合的特性，相比之下，C-hordein不會(huì)優(yōu)先與LMP、HMP結(jié)合。

觀察上清液的電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在質(zhì)量比10∶1時(shí)，上清液中均明顯含有C-hordein與B-hordein，隨著果膠比例的增大，Hordein/LMP中B-hordein條帶的顏色逐漸變淺，即上清液中B-hordein的含量逐漸降低，這是因?yàn)樵絹?lái)越多的B-hordein與LMP結(jié)合并形成復(fù)凝聚物，然而，在Hordein/HMP中無(wú)法觀察到這一趨勢(shì)。這一現(xiàn)象說(shuō)明，LMP與B-hordein的結(jié)合能力強(qiáng)于HMP，這可能是因?yàn)長(zhǎng)MP的電位絕對(duì)值相對(duì)較大，因而具有更強(qiáng)的結(jié)合能力。

然而，即使在Hordein/LMP1:1的上清液中，仍能觀察到微量的B-hordein（紅色虛線部分），說(shuō)明仍有少量B-hordein未能與LMP結(jié)合，即少量B-hordein未能被有效地分離。實(shí)驗(yàn)中，若繼續(xù)增大LMP、HMP的比例，蛋白/果膠復(fù)合物將變得可分散，無(wú)法形成復(fù)凝聚物。所以，通過(guò)HMP無(wú)法實(shí)現(xiàn)B-hordein與C-hordein的分離，通過(guò)LMP可分離大部分的B-hordein。

基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，收集Hordein/LMP1:1體系下的復(fù)凝聚物與上清液，并根據(jù)1.3.6節(jié)所述方法進(jìn)行蛋白質(zhì)組分的分離。結(jié)果顯示，上清液中蛋白樣品的回收率為（32.66±3.08）%；復(fù)凝聚物中的蛋白組分可以與LMP有效分離，蛋白樣品的回收率為（65.29±1.74）%，基于電泳結(jié)果進(jìn)行推測(cè)，這些蛋白樣品均為B-hordein。此外，通過(guò)苯酚-硫酸法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，上清液、復(fù)凝聚物中蛋白組分獲得的果膠殘留率均小于4.0 μg/g，說(shuō)明分離得到的蛋白樣品中不含有LMP。

05

蛋白質(zhì)譜分析

取圖6部分Hordein/LMP1:1中復(fù)凝聚物與上清液對(duì)應(yīng)的電泳凝膠，將電泳條帶完整切下，用于質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)。根據(jù)肽段序列進(jìn)行匹配并計(jì)算emPAI，并按照豐度的大小排序。如表1所示，復(fù)凝聚物中共鑒定出27 種多肽，其中大多數(shù)為B-hordein的部分片段，同時(shí)，比較了29 個(gè)肽段的emPAI值，結(jié)果顯示，鑒定為B-hordein的多肽具有較高豐度，尤其是prf||1103203A的emPAI值可達(dá)27 930。相比之下，雖然也鑒定出C、D和γ-hordein的部分片段，但這些蛋白組分的emPAI值較低，均小于200。以上結(jié)果說(shuō)明，B-hordein占所獲取復(fù)凝聚物的絕大多數(shù)。

如表2所示，上清液中鑒定出30 條多肽，這些多肽分別來(lái)自B、C、D-hordein和γ-hordein。與其他組分相比，被鑒定為C-hordein的多肽具有較高的豐度。其中，AAA32943.1的emPAI值為10 702，遠(yuǎn)高于其他多肽。這說(shuō)明，C-hordein占所獲取上清液的絕大多數(shù)。此外，同時(shí)檢測(cè)到了序列號(hào)為prf||1103203A的B-hordein，這與電泳結(jié)果相符。上述質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在Hordein/LMP1:1混合體系中，大部分B-hordein優(yōu)先與LMP結(jié)合，借助這一選擇性結(jié)合機(jī)制，雖然無(wú)法將B、C-hordein組分完全分離，但可以從復(fù)凝聚物中獲得以B-hordein為主的蛋白組分，即該蛋白組分中B-hordein的純度較高。基于此，將復(fù)凝聚物、上清液中分離得到的蛋白組分記作“B-hordein”與“C-hordein”，通過(guò)后續(xù)實(shí)驗(yàn)比較不同蛋白組分的黏附效果。

06

黏度與模量

通過(guò)檢測(cè)復(fù)合物（Hordein/CS、B-hordein/CS、C-hordein/CS）、黏蛋白以及二者混合物的黏度值，選取剪切速率r為2、10 s-1時(shí)的黏度值進(jìn)行分析，評(píng)價(jià)不同蛋白組分的黏附效果。如表3所示，3 種復(fù)合物的ηenhancement均大于0且ηrelative均大于1，說(shuō)明其在生理?xiàng)l件下均具有良好的黏附效果。這可能是由于CS是陽(yáng)離子多糖，當(dāng)其覆蓋在蛋白表面時(shí)，復(fù)合物與黏蛋白之間存在一定的靜電引力，且CS含有的羥基、氨基等極性基團(tuán)，使復(fù)合物具有吸水溶脹的特性，進(jìn)一步增強(qiáng)了復(fù)合物的黏附效果。當(dāng)r＝2 s-1時(shí)，B-hordein/CS的ηenhancement為（238.9±14.3）mPa·s，ηrelative為3.78±0.10，顯著高于Hordein/CS與C-hordein/CS復(fù)合物（P＜0.05）；當(dāng)r＝10 s-1時(shí)B-hordein/CS表現(xiàn)出相同的趨勢(shì)，說(shuō)明B-hordein/CS復(fù)合物與黏蛋白結(jié)合后的黏附效果更強(qiáng)。這可能是由復(fù)合物的粒徑、分散性等多種因素的改變而共同導(dǎo)致的。

進(jìn)一步通過(guò)拉伸實(shí)驗(yàn)比較復(fù)合物的黏附能力。如表4所示，B-hordein/CS的最大分離力為13.8 mN，與Hordein/CS的數(shù)值（13.2 mN）接近，顯著高于C-hordein/CS（12.3 mN）（P＜0.05）；B-hordein/CS的總黏附功為29.8 μJ，顯著高于C-hordein/CS（25.9 μJ）（P＜0.05）。B-hordein與Hordein的結(jié)果接近，這可能是因?yàn)锽-hordein是Hordein的主要組分；B-hordein的黏附效果優(yōu)于C-hordein，可能是由于B-hordein/CS復(fù)合物的粒徑更小，因?yàn)榧{米顆粒的粒徑對(duì)其黏膜吸附與細(xì)胞攝取具有重要影響。Luo Yangchao等使用CS納米顆粒負(fù)載并遞送亞硒酸鈉，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，減小CS納米顆粒的粒徑可以有效增強(qiáng)其黏附效果，同時(shí)提高黏膜對(duì)亞硒酸鈉的吸收效率。這一結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明B-hordein/CS復(fù)合物與黏蛋白結(jié)合后的黏附效果更強(qiáng)。由此推測(cè)，基于B-hordein/CS復(fù)合物的遞送載體具有更強(qiáng)的腸道黏附能力，這有利于增大其遞送效果。

結(jié)論

本研究通過(guò)表征大麥醇溶蛋白與LMP和HMP的選擇性復(fù)凝聚反應(yīng)，優(yōu)化了B-hordein的分離方法，評(píng)估了不同蛋白組分的黏附性能。結(jié)果表明，B-hordein作為大麥醇溶蛋白的主要組分，優(yōu)先與LMP和HMP結(jié)合形成復(fù)凝聚物，其中LMP因其較低的酯化度和較高的電荷密度，表現(xiàn)出更強(qiáng)的結(jié)合能力。通過(guò)Hordein/LMP1:1體系的復(fù)凝聚物，成功分離出純度較高的B-hordein，回收率可達(dá)65.29%，且果膠殘留率低于4.0 μg/g。HPLC-Q-Exactive-MS/MS進(jìn)一步證實(shí)了復(fù)凝聚物中B-hordein的蛋白質(zhì)豐度顯著高于其他組分。主要反應(yīng)均在分散液中進(jìn)行，無(wú)需高精度的檢測(cè)儀器，因此該工藝具有工廠化、規(guī)模化的開發(fā)潛力。此外，黏附性能研究結(jié)果表明，B-hordein與CS形成的復(fù)合物（B-hordein/CS）表現(xiàn)出最佳的黏附效果。流變學(xué)測(cè)試顯示，B-hordein/CS的ηenhancement與ηrelative顯著高于其他復(fù)合物（P＜0.05）。拉伸實(shí)驗(yàn)也表明，B-hordein/CS的最大分離力和總黏附功均優(yōu)于C-hordein/CS，驗(yàn)證了其在構(gòu)建黏膜吸附型遞送系統(tǒng)中的潛在價(jià)值。綜上所述，本研究驗(yàn)證了選擇性結(jié)合現(xiàn)象在分離蛋白組分中的應(yīng)用潛力，提出了一種高效、低成本的B-hordein分離技術(shù)，為深入探究其理化性質(zhì)及在功能食品和藥物遞送領(lǐng)域的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。后續(xù)研究可進(jìn)一步優(yōu)化分離工藝，提高回收率，進(jìn)而探索B-hordein在復(fù)雜食品體系或生物醫(yī)學(xué)材料中的實(shí)際應(yīng)用潛力。

作者簡(jiǎn)介

通信作者：

李非凡，山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院講師，工學(xué)博士，畢業(yè)于中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)。現(xiàn)任山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院講師，主要研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與蛋白質(zhì)/多糖復(fù)凝聚反應(yīng)；發(fā)表多篇學(xué)術(shù)論文，其中以第一作者身份發(fā)表SCI論文5 篇；參與申請(qǐng)2 項(xiàng)發(fā)明專利；曾參與國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)與國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃專項(xiàng)。

本文《B-大麥醇溶蛋白的分離優(yōu)化與黏附效果》來(lái)源于《食品科學(xué)》2025年46卷第19期79-88頁(yè)，作者：李非凡，遲曉君，秦 洋，卜令金，時(shí)宇航。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250421-167。點(diǎn)擊下方閱讀原文即可查看文章相關(guān)信息。

實(shí)習(xí)編輯：南伊；責(zé)任編輯：張睿梅。點(diǎn)擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來(lái)源于文章原文及攝圖網(wǎng)