《食品科學》：華南農業大學肖蘇堯副教授等：酪蛋白磷酸肽-硒螯合物結構表征、體外免疫和抗炎活性分析

硒（Se）是人體內一種必需的微量礦物質，對人類和動物機體的正常生命活動具有重要作用，其主要能夠抑制炎癥反應和減輕氧化應激。人體無法自行合成硒，所以飲食攝入是補充硒的唯一途徑。

目前，常見的硒補充劑有兩種形式，分別是無機硒（Na2SeO3等）和有機硒，其中有機硒產品包括富硒酵母、富硒蘑菇、富硒大米、富硒肉類以及富硒發酵羊奶，是通過施肥或發酵的方式富集硒元素。然而，由于這種形式的周期長、富硒量小、成本高，因此一種新型的有機硒補充方法——有機硒螯合物應運而生。

有機硒螯合物的載體在整體中起重要作用，例如蛋白質和多糖等大分子物質，以及多肽、氨基酸和姜黃素等小分子物質。本研究利用牛乳中一種生物活性肽——酪蛋白磷酸肽（CPP）作為硒補充劑的載體，CPP是從牛乳蛋白水解而來的生物活性磷酸化肽類，其特征是絲氨酸和蘇氨酸殘基上存在磷酸基團，現有研究表明其螯合效果可以提高必需礦物質生物利用度。

華南農業大學食品學院的李康瑗、王嘉煒、肖蘇堯*等制備酪蛋白磷酸肽-硒螯合物（CPP-Se），通過光譜學、熱力學手段以及分子對接技術進行表征，并評估螯合物在RAW264.7巨噬細胞炎癥模型中的免疫和抗炎活性，旨在為開發一種潛在的新型硒補充劑提供理論基礎。

1 CPP-Se螯合條件的優化

1.1 單因素試驗結果

由圖1A可知，硒含量隨著肽硒質量比的增長先升高再降低，在肽硒質量比3∶1時達到最高值，故在后續實驗中，選擇肽硒質量比3∶1為反應條件。由圖1B可知，當螯合pH值逐漸升高時，硒含量先升高再降低，在pH 6.0時達到峰值，說明在弱酸的條件下，肽鏈結構更加緊湊，從而能更加有效地結合硒元素，這與劉俊霞等的結果一致。從圖1C可以看出，隨著溫度的升高，硒含量先升高后降低，在30 ℃條件下硒含量最高，但溫度過高時硒含量降低，分析原因可能是高溫會使得肽鏈變性，過度展開，影響配位構象，不利于形成螯合物。由圖1D可知，螯合溫度對螯合物的硒含量影響不明顯，在20～120 min范圍內，硒含量處于3 500 μg/g左右，40 min時硒含量較高，其余時間變化幅度不大，故后續響應面試驗選擇肽硒質量比、螯合pH值、螯合溫度作為試驗因素。綜上，通過單因素試驗得到的最適螯合條件為肽硒質量比3∶1、螯合pH 6.0、螯合溫度30 ℃、螯合時間40 min?；趩我蛩卦囼灥慕Y果，以肽硒質量比、螯合pH值和螯合溫度為影響因素進行后續響應面試驗，因素水平設計如表3所示。

1.2 響應面優化結果

以肽硒質量比、螯合pH值、螯合溫度作為因素，以硒含量為響應值，運用Design-Expert 12軟件對CPP-Se制備工藝進行設計，最終以3因素3水平的中心組合進行試驗，并通過顯色法檢測螯合物中硒含量，結果見表4。

1.3 模型建立與顯著性檢驗

運用Design-Expert 12軟件對CPP-Se硒含量試驗結果進行方差分析，獲得硒含量（

Y

）的回歸方程：

Y

＝3 488.41-665.04

A

＋812.67

B

＋80.18

C

＋517.72

AB

AC

＋454.06

BC

＋ 194.92

A

2 ＋657.68

B

2 -62.66

C

2 ， 回歸方程方差分析結果如表5所示。

如表5所示，

P

值為0.006 6表明模型顯著，具有統計學意義，各因素對硒含量的影響大小依次為

B

A

C

B

2對硒含量影響較顯著，

AB

交互作用對硒含量影響較顯著，其他交互作用對硒含量影響的不顯著，

R

2和

R

2Adj分別為決定系數和校正決定系數，用來表示回歸方程擬合度。表中，

R

2和

R

2Adj分別為90.86%、79.12%，擬合精度相對較高，且均大于0.5，并且相差0.2左右，表明方程均到達顯著水平，模型可使用，具有參考價值。

1.4 參數優化與實驗驗證

利用Design-Expert 12軟件對實驗數據進行優化預測，得到最優工藝參數組合為肽硒質量比2∶1、螯合pH 7.0、螯合溫度35.48 ℃，該工藝條件下CPP-Se的硒含量預測值為5 578.66 μg/g。為保證實驗數據的準確性，對最優工藝參數進行驗證實驗，驗證結果見表6?？梢园l現，評價指標的實驗值和驗證值之間的相對誤差均小于2%，證明了該工藝參數的可行性。

2 結構表征結果

2.1 粒徑和電位、紫外-可見光譜以及FTIR結果分析

如圖2A所示，CPP和CPP-Se的平均粒徑分別為389.4 nm和420.6 nm。與CPP相比，CPP-Se粒徑略有增加，表明Se的加入可能導致CPP結構的平鋪和分散。分析CPP和Se之間的相互作用不僅涉及分子內相互作用，還涉及分子間相互作用，導致肽結構聚集和折疊；有研究表明，肽鏈末端的硒螯合可能使肽鏈伸長，導致粒徑增加。如圖2B所示，CPP和CPP-Se的Zeta電位分別為-14.45 mV和-9.12 mV。螯合物的Zeta電位絕對值降低，可能是硒離子的加入會與體系中其他帶電粒子發生相互作用，導致表面電荷分布發生變化，使得暴露在外的電荷減少，形成較低的Zeta電位絕對值。此外，Zeta電位絕對值越低，靜電斥力越小，這有助于聚集分子并產生更大的顆粒，這與粒徑分析結果相印證。

如圖2C所示，CPP的特征吸收峰在222 nm左右，與硒螯合后藍移至216 nm。222 nm附近的最大吸收峰歸因于羰基、羧基、酰胺鍵和芳香族氨基酸殘基的n?π*躍遷，而270 nm附近的另一個吸收峰是芳香族氨基酸殘基引起的。螯合后，吸收峰的偏移推測可能是由硒與肽末端的N和O鍵配對后，引起肽鍵上羰基的n?π*躍遷，從而影響了C＝O的電子躍遷。配位化合物的形成改變了其配體的光吸收特性，峰的遷移和強度變化均表明CPP和硒成功螯合。

為了進一步檢測可能的結合基團，使用FTIR區分螯合前后光譜差異，結果如圖2D所示。圖中3 300 cm -1 處 的吸收峰歸因于CPP中—OH的伸縮振動，硒螯合后該譜帶發生了一定的變化，表明—COOH可能參與了CPP-Se的形成。3 300～3 352 cm -1 的吸收峰變化表明N—H伸縮振動參與了螯合過程，可能是由于硒的引入影響了N—H鍵周圍的電子云分布，進而影響了N—H鍵的電子密度，導致伸縮振動峰的移動。CPP與硒螯合后，酰胺I帶中1 650 cm -1 移至1 658 cm-1是由羰基C＝O拉伸振動引起，表明在硒離子的存在下CPP的羰基可能發生變化，這可能是由于螯合物的分子內氫鍵強度降低，更多的C＝O為Se離子提供了配位位點。特征吸收峰從1 093 cm-1移動到1 102 cm-1，表明磷酸基團可能與硒離子結合。綜上，硒離子可能通過氨基、羰基和磷酸基團與CPP結合，形成CPP-Se。

2.2 CD、XRD以及TGA結果分析

CD是評估蛋白質和多肽結構變化及穩定性的一個重要手段，譜圖曲線零點通常出現在250 nm左右，可以反映分子的整體構象。通常在CD譜圖中，

-螺旋在200 nm及222 nm左右出現兩個負吸收峰；

-折疊在215 nm和195 nm附近有負吸收峰；

-轉角主要通過在約218 nm處的負吸收峰體現；無規卷曲結構則對應195 nm附近的較弱峰。由圖3A可知，CPP-Se和CPP的CD譜圖在約200 nm處均有個較大的負峰，在222 nm處均有小型峰，說明兩者都存在

-螺旋，譜圖中195、215 nm和218 nm也出現負吸收峰，說明CPP-Se和CPP中存在

-折疊、

-轉角和無規卷曲結構。相比CPP，CPP-Se的峰值強度降低，表明在螯合過程中，螯合物的二級結構（

-螺旋、

-折疊、

-轉角和無規卷曲）發生變化。

圖3B所示，CPP-Se螯合物的

-螺旋和

-折疊相對含量分別提高了0.57%和8.13%，

-轉角和無規卷曲結構相對含量分別下降了1.16%和7.53%，說明CPP-Se的螯合過程導致

-折疊含量顯著增加，螯合過程誘導無規卷曲結構轉變為

-折疊，使得多肽結構更加有序和緊湊。該結果初步表明螯合物電荷降低可能與CPP更加有序排列有關，且與Hu Shengjie和Zhai Wenliang等的研究結果相似。

如圖3C所示，CPP和CPP-Se的衍射峰強度較強，但是譜圖中沒有尖銳精細的峰，峰寬較大，螯合后整體響應值降低，硒的添加使主要的衍射峰從21.54°偏移至22.72°，由此可以判斷CPP和CPP-Se均為無定形結構，結合粒徑結果分析，CPP-Se是小粒徑、無定形的非晶型結構。結果表明，與硒螯合的CPP結構多種多樣，導致無定形結構和結晶度增加，表明肽與硒或其他離子的螯合可能會導致結構變化。

為了探究CPP和CPP-Se的熱穩定性，在30～800 ℃的N2條件下研究了CPP（圖3D1）和CPP-Se（圖3D2）的熱重-微分熱重曲線。CPP和CPP-Se的質量損失主要分為兩個階段，在第1階段30～300 ℃范圍內的質量損失主要是由于水分的損失，在第2階段超過300 ℃時，肽鏈上不同位置的氫鍵和化學鍵開始斷裂，有機物逐漸分解。在微分熱重曲線中可以發現溫度在300～500 ℃時，樣品質量損失速率急劇加快，而600 ℃之后，質量損失速率平穩。第2階段中，CPP質量損失率為61.16%，CPP-Se螯合物質量損失率為58.47%，說明CPP-Se的熱穩定性更強，這表明螯合后CPP和硒離子的分子間和分子內作用力增加，因此需要更高的溫度破壞這些力。另有研究表明，由于硒的存在，螯合物在相同溫度下的熱質量損失較低，灰分含量高于肽，這與本實驗結果相符。

2.3 等溫滴定量熱分析結果

如圖4A所示，每個峰表示每一滴等體積的溶液離子滴定至多肽溶液中產生的熱量，所有滴定曲線的峰值均向上，即峰值為正，表明結合作用都是吸熱的。當多肽上的空位逐漸被Se絡合后，結合反應吸收的熱量逐漸減少，峰值逐漸減小，至最后飽和。

如圖4B所示，滴定擬合曲線符合“one-set of site”模型，擬合后確定結合位點數

N

、 摩爾焓變Δ

H

0 、摩爾熵變Δ

S

0 和結合常數

K

a 。 根據摩爾焓變ΔH0和摩爾熵變 Δ

S

0 ，可通過熱力學方程計算得到摩爾吉布斯自由能變Δ

G

0 。 Se（IV）與多肽的結合過程中，結合位點數

N

＝0.889，結合常數

K

a ＝1.65×104 L/mol，說明兩者之間的結合能力不是特別強，Δ

H

0 ＞0的同時Δ

S

0 ＞ 0， 則表明硒離子主要是在疏水相互作用的驅動下絡合到多肽上，與此同時， |Δ

H

0 |＝3.874 kcal＜＜|

T

S

0 |＝ 298 K×32.3＝9.625 kcal，表明絡合是由熵驅動為主的焓熵驅動過程，疏水作用在絡合過程中起的作用更大。

2.4 分子對接模擬可能結合位點

分子對接技術通常用于研究蛋白質/多肽與離子之間的分子作用力，并預測其結合模型，對接結果如表7所示，CPP中P5單體的結合能絕對值最高，表明在5 個單體中P5的結合效果最好，其次為P3，通過實驗得出單體P5與 SEO 3 2- 螯合后的螯合物硒含量最高，印證了分子對接預測的結果，可以發現，結合效果好的肽段分子質量相對較低，說明肽段分子質量可能也是螯合能力的影響因素之一。

通過Vina法將P5與 SEO 3 2- 進行對接，如圖5所示，P5中絲氨酸、谷氨酸、亮氨酸、纈氨酸是可能的結合位點，且Model 1的結合能最高，為1.8 kcal/mol；再運用pymol軟件模擬對接模型，圖6為P5與 SEO 3 2- 對接建立的最可靠的結合模型，可以看出螯合位點為絲氨酸SER-23中的氫鍵（黃色虛線），位于磷酸基團，距離為2.6 ?，結合能為-7.53 kJ/mol，對接結果良好，兩者螯合效果良好，判斷可以形成穩定結構。

進一步分析，CPP主要通過氫鍵和疏水相互作用力與 SEO 3 2- 結合，主要結合位點在磷酸基團附近，這與FTIR結果相印證。絲氨酸、谷氨酸、亮氨酸、纈氨酸等都參與了螯合過程，其中大多數屬于酸性和疏水性氨基酸，主要是氫鍵和疏水相互作用力作為動力。分析可能是在弱堿性條件下肽鏈容易暴露出更多疏水性氨基酸，另外據報道，帶負電荷的酸性氨基酸和疏水性氨基酸殘基的羧基在螯合反應中起重要作用。

3 體外免疫與抗炎活性分析

3.1 細胞毒性

巨噬細胞作為重要的免疫調節細胞，在維持免疫系統平衡和防御入侵病原體方面發揮著至關重要的作用。采用MTT法檢測不同質量濃度CPP-Se、 Na 2 SeO 3 和CPP處理后的RAW264.7巨噬細胞活力。如圖7所示，RAW264.7巨噬細胞暴露于不同質量濃度的3組樣品24 h后，當CPPSe中硒質量濃度為0～0.15 μg/mL時，細胞活力無明顯下降，當硒質量濃度達到0.2 μg/mL時，細胞活力較對照組顯著下降（

P

＜0.05）；而Na2SeO3中硒質量濃度在0～0.05 μg/mL時對細胞活力影響不大，當達到0.1 μg/mL時，細胞活力較對照組顯著下降（

P

＜0.05）；在0.01～5 mg/mL范圍內CPP不呈現毒性。結果表明，經過CPP螯合后，硒溶液的毒性范圍發生變化，最高使用質量濃度從0.05 μg/mL提升至0.15 μg/mL，說明CPP-Se的安全使用質量濃度范圍擴大了2 倍，這為CPP-Se的安全使用提供了有力保障。后續實驗選擇CPP-Se和Na2SeO3的硒質量濃度分別0.012 5、0.025、0.05 μg/mL，CPP質量濃度分別3.312 5、6.625、13.25 μg/mL作為不同劑量濃度（低、中、高質量濃度），以防止細胞毒性影響實驗結果。

3.2 吞噬能力

巨噬細胞通過吞噬功能攝取外源病原微生物，是機體最重要的非特異性免疫反應之一，吞噬能力的增強是巨噬細胞活化的常用評估指標。當病原體入侵時，巨噬細胞可通過吞噬作用破壞、消除病原體，修復組織。如圖8所示，經過CPP-Se、 Na 2 SeO 3 不同劑量處理后，巨噬細胞表現出一定的吞噬活性，且呈劑量-效應關系，尤其在高質量濃度作用下，相較于空白組，CPP-Se組的吞噬能力提升了25%，吞噬能力顯著提高（

P

＜0.01）。

3.3 對巨噬細胞炎癥模型細胞因子NO、TNF-α和IL-6水平的影響

機體免疫系統可以通過分泌炎癥因子阻擋和抵抗外來入侵者，但如果過度分泌炎癥因子，則會影響機體本身，導致自身免疫系統紊亂，可通過減少炎癥因子分泌調節免疫系統，防止免疫系統被過度激活。根據吞噬能力結果，選擇高濃度樣品（CPP-Se和 Na 2 SeO 3 的硒質量濃度均為0.05 μg/mL、CPP等樣質量濃度為13.25 μg/mL）進行實驗。如圖9所示，LPS組與空白組對比，NO、TNF-

和IL-6釋放量高度顯著增加（

P

＜0.001），表明1 μg/mL LPS能夠成功誘導RAW264.7巨噬細胞的免疫應激反應。與LPS共處理后，CPP-Se組和Na2SeO3組可以顯著抑制RAW264.7巨噬細胞中NO、TNF-

和IL-6的分泌與釋放。其中，在相同的硒質量濃度下，CPP-Se組比Na2SeO3組展現出更強的抑制效果，表明螯合硒更有利于緩解炎癥狀態。然而CPP組對NO、TNF-

和IL-6的抑制效果并不顯著，說明CPP并不影響NO、TNF-

和IL-6的分泌與釋放。總體而言，CPP-Se和Na2SeO3可以有效抑制LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞中NO、TNF-

和IL-6的分泌與釋放，其中CPP-Se具有更顯著的抑制效果。Jiang Pingyingzi等的研究表明，硒與氨基酸/肽的結合可能對抗炎活性有積極影響。

結論

本研究制備了一種新型硒補充劑CPP-Se，并利用光譜學、熱力學和分子對接技術等不同方法對其結構進行了表征，同時采用體外細胞模型RAW264.7巨噬細胞評估其免疫和抗炎活性。結果表明，在肽硒質量比2∶1、螯合pH 7.0、螯合溫度35.48 ℃的最佳工藝條件下，CPP-Se的硒含量達到5 578.66 μg/g；CPP和硒的螯合過程主要與氨基、羧基、磷酸基和羰基有關，肽鏈的二級結構

-折疊受到影響。與CPP相比，最終獲得的CPP-Se具有更強的熱穩定性。此外，使用分子對接技術模擬潛在的結合位點和模型，得出肽鏈中主要是絲氨酸、谷氨酸、亮氨酸、纈氨酸等參與螯合過程；更重要的是，CPP-Se可以顯著提升RAW264.7巨噬細胞的吞噬能力，在同等硒質量濃度條件下，CPP-Se對NO、TNF-

和IL-6產生和釋放的抑制作用顯著優于 Na 2 SeO 3 ，本研究可為未來開發具有免疫調節活性的硒補充劑提供新的思路。

第一作者：

李康瑗 碩士研究生

華南農業大學食品學院

2018年考入湖南農業大學就讀食品科學與工程專業，本科；2022年考入華南農業大學就讀食品加工與安全專業，碩士。本人主要研究方向為天然產物活性功能，在校期間，參與過《?子營養成分分析及其抗氧化活性組分鑒定》、《Enzymatic synthesis and in vitro digestion characteristics of human milk fat substitutes 1,3-dilinoleoyl-2-palmitoylglycerol》等文章的發表，2022—2025年間連續獲得華南農業大學學業獎學金。

通信作者：

肖蘇堯 副教授

華南農業大學食品學院

研究方向為天然產物活性功能，2002年考入湖南大學就讀分析化學專業碩士，2004年提前攻讀分析化學博士學位，2007年6月博士畢業，2013 — 2014年在美國瑪莎諸塞州立大學國家公派訪問學者，2007年6月獲理學博士學位并到華南農業大學工作至今。本人主要承擔本科生《食品化學》《食品儀器分析》和《實驗設計與數據處理》等課程的教學工作，承擔研究生的《高級食品化學》等課程。研究方向為膳食中天然功能因子的提取分離、功能解析、分析檢測及其終端產品開發。曾主持過《藍莓全果粉冷凍干燥加工工藝研發及生產設備配套設計》、《迷迭香提取物作為食品添加劑的應用研究》等橫向課題。

本文《酪蛋白磷酸肽-硒螯合物結構表征、體外免疫和抗炎活性分析》來源于《食品科學》2025年46卷第18期25-35頁，作者：李康瑗，王嘉煒，陳立平，鐘如茵，劉嘉敏，王祺皓，周愛梅，曹 庸，肖蘇堯*。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20250113-091。點擊下方閱讀原文即可查看文章相關信息。

實習編輯：農夢琪；責任編輯：張睿梅。點擊下方 閱讀原文 即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網