神經(jīng)環(huán)路應(yīng)用（35）丨RNAscope技術(shù)簡介及原位雜交實(shí)驗(yàn)方法

RNAscope是一種高靈敏度、高特異性的原位雜交（ISH），廣泛應(yīng)用于組織切片中單細(xì)胞甚至亞細(xì)胞水平的RNA定位與定量檢測。

Fig1 RNAscope流程簡圖

主要優(yōu)勢

單分子靈敏度：可在顯微鏡下看到離散的“點(diǎn)”，每個點(diǎn)代表一個RNA轉(zhuǎn)錄本；

高特異性：雙Z探針設(shè)計(jì)可區(qū)分單堿基差異（如SNP、剪接變體、突變 vs 野生型）；

多重檢測：支持2–4色熒光或與IHC聯(lián)用；

半定量分析：可通過點(diǎn)計(jì)數(shù)進(jìn)行細(xì)胞間表達(dá)水平比較；

保留組織結(jié)構(gòu)：適用于神經(jīng)科學(xué)中的腦區(qū)定位、細(xì)胞類型共標(biāo)等。

腦組織提取

藥物注射與腦組織采集分兩天進(jìn)行。

第1天：對小鼠稱重后，腹腔注射F17464或生理鹽水，并將其單獨(dú)置于籠中。30分鐘后，再次腹腔注射MK-801或生理鹽水，隨后將小鼠放回原籠繼續(xù)飼養(yǎng)60分鐘。此后，每隔4分鐘取出一只小鼠，通過頸椎脫臼法實(shí)施安樂死隨即斷頭。在無RNA酶條件下，迅速取出腦組織，用生理鹽水輕柔沖洗，吸水紙吸干多余液體并按以下程序快速冷凍。

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腦組織冷凍

將8個Pyrex燒杯各加入250 ml異戊烷，置于裝有干冰顆粒的聚苯乙烯泡沫箱中并在通風(fēng)櫥下排列成一行。使用超低溫溫度計(jì)監(jiān)測異戊烷溫度。當(dāng)溫度降至?20°C時，用刮刀快速攪拌異戊烷形成漩渦。將小鼠腦組織輕輕置于漩渦表面，使其迅速沉底并完成冷凍。隨后，將含樣本的燒杯繼續(xù)置于干冰上靜置30分鐘，使組織溫度充分平衡至干冰溫度。

該方法可在血管離斷后4分鐘內(nèi)實(shí)現(xiàn)大批量小鼠腦組織的均勻快速冷凍，有效保存組織形態(tài)及100%的目標(biāo)mRNA，這對于低至中等表達(dá)水平的mRNA尤為重要。相比之下，石蠟包埋組織約損失25%的mRNA信號。需注意，若使用液氮等更低溫度冷凍某些組織可能出現(xiàn)裂紋導(dǎo)致后續(xù)切片困難。整個操作在通風(fēng)櫥中進(jìn)行并全程使用無RNA酶耗材。冷凍后的腦組織存放于?80°C的15 ml無RNA酶Eppendorf管中。第2天對剩余20只小鼠重復(fù)相同流程。所有冷凍腦樣本用于RNAscope原位雜交檢測c-fos mRNA表達(dá)。

RNAscope原位雜交實(shí)驗(yàn)方法

采用RNAscope?熒光原位雜交（FISH）技術(shù)檢測小鼠腦組織中c-fos mRNA的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)使用4%多聚甲醛后固定的冷凍冠狀腦切片（10 μm厚）。選定5分鐘輕度消化作為標(biāo)準(zhǔn)流程，因其在保持組織形態(tài)完整性的同時獲得最佳信噪比。

所有染色操作均在Leica Bond RX全自動染色平臺上進(jìn)行，使用ACD Bio（Advanced Cell Diagnostics）試劑與探針。每輪實(shí)驗(yàn)同步包含以下探針：目標(biāo)探針 Mm-fos、陽性對照探針 Mm-PPIB和陰性對照探針 DapB。

染色流程依次為：ACD蛋白酶K處理→ 探針雜交→ 信號放大→ LS緩沖液清洗 → Mixed Red Refine顯色 → DAPI復(fù)染細(xì)胞核。染色完成后，載玻片經(jīng)去離子水沖洗，60°C烘干，二甲苯透明并以Ecomount封片劑封片。封片后立即進(jìn)行全片掃描或于–20°C避光短期保存。該流程基于ACD Bio的多級分支DNA（bDNA）信號放大系統(tǒng)，在保證高特異性的同時實(shí)現(xiàn)單分子mRNA的可視化，為后續(xù)定量分析奠定基礎(chǔ)。

總結(jié)

RNAscope 技術(shù)是神經(jīng)環(huán)路研究中精準(zhǔn)定位基因表達(dá)的核心工具，憑借單分子級靈敏度、高空間分辨率及多靶標(biāo)同時檢測的優(yōu)勢能在組織原位實(shí)現(xiàn)特定 RNA 的高分辨率可視化，其核心應(yīng)用包括通過靶向神經(jīng)元標(biāo)志物 RNA（如 Slc17a7、Gad1）精準(zhǔn)鑒定環(huán)路細(xì)胞構(gòu)成，結(jié)合神經(jīng)示蹤技術(shù)同步檢測投射神經(jīng)元與功能基因（如受體、離子通道 RNA）以揭示環(huán)路連接與基因表型的關(guān)聯(lián)，以及在發(fā)育或病理狀態(tài)下追蹤突觸蛋白、神經(jīng)遞質(zhì)合成酶等關(guān)鍵基因的時空表達(dá)變化以闡明環(huán)路可塑性機(jī)制，為解析神經(jīng)環(huán)路的組成與功能提供了關(guān)鍵技術(shù)支撐。

文獻(xiàn)引用：

• Cosi C, Millar M, Beltran M, Sherry L, Gatti-McArthur S. Quantitative analysis of RNAscope staining for c-fos expression in mouse brain tissue as a measure of Neuronal Activation. MethodsX. 2021 Apr 20;8:101348. doi: 10.1016/j.mex.2021.101348. PMID: 34430251; PMCID: PMC8374392.

• Hazra R, Spector DL. Simultaneous visualization of RNA transcripts and proteins in whole-mount mouse preimplantation embryos using single-molecule fluorescence in situ hybridization and immunofluorescence microscopy. Front Cell Dev Biol. 2022 Oct 4;10:986261. doi: 10.3389/fcell.2022.986261. PMID: 36268512; PMCID: PMC9577017.

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