意外發(fā)現(xiàn)就是一篇Nature！生物催化消旋化，合成對映體純的阻轉(zhuǎn)異構(gòu)體

導(dǎo)讀

近日，密歇根大學(xué)Alison R. H. Narayan教授課題組在

Nature

正文

手性分子在藥物、農(nóng)藥和材料科學(xué)中具有至關(guān)重要的作用，不同對映異構(gòu)體在生物活性、毒性和代謝途徑上可能表現(xiàn)出顯著差異。在眾多手性分子中，軸手性化合物因其在不對稱催化、手性配體和藥物分子中的廣泛應(yīng)用而備受關(guān)注。軸手性來源于分子中單鍵旋轉(zhuǎn)受阻，導(dǎo)致兩個對映體在空間構(gòu)型上不可互換。傳統(tǒng)的軸手性分子合成方法主要包括：1）對映選擇性合成，通過手性催化劑直接構(gòu)建軸手性（圖1a）。2）拆分技術(shù)，如色譜分離或結(jié)晶法，但最大理論產(chǎn)率僅為50%，且過程繁瑣、成本高。

圖1. 阻轉(zhuǎn)異構(gòu)體體的立體動力學(xué)反應(yīng)（圖片來源：Nature）

去消旋化（deracemization）是一種理想的手性合成策略，可將外消旋混合物轉(zhuǎn)化為單一對映體，理論上可實現(xiàn)100%的產(chǎn)率。然而，由于軸手性分子對映體之間的相互轉(zhuǎn)化依賴于鍵的旋轉(zhuǎn)，而非鍵的斷裂與形成，其能壘較高，實現(xiàn)催化性去消旋化極具挑戰(zhàn)（圖1b）。

本文報道了一種基于新發(fā)現(xiàn)的P450酶消旋化活性的新型催化立體趨同合成阻轉(zhuǎn)異構(gòu)體的方法。酶相較于許多小分子催化劑具有優(yōu)勢，因為它們可以與底物的整體結(jié)構(gòu)相互作用，從而控制成鍵過程和構(gòu)象變化（圖1c）。作者提出酶的活性位點也可以通過促進(jìn)鍵旋轉(zhuǎn)而非鍵形成來模板化構(gòu)象變化，從而驅(qū)動阻轉(zhuǎn)異構(gòu)體的對映體富集。該方法提供了一種依賴于可控鍵旋轉(zhuǎn)而非鍵形成的生物催化阻轉(zhuǎn)異構(gòu)體合成途徑。歡迎下載化學(xué)加APP到手機(jī)桌面，合成化學(xué)產(chǎn)業(yè)資源聚合服務(wù)平臺。

由于BINOL衍生物在不對稱催化中至關(guān)重要，本文最初的目標(biāo)是開發(fā)一種通用的生物催化氧化偶聯(lián)反應(yīng)，以合成對稱和非對稱的BINOL類化合物。作者構(gòu)建了一個小型還原酶融合細(xì)菌P450庫，該庫可在大腸桿菌中表達(dá)，并適用于體外反應(yīng)。從該庫中，篩選出一種野生型P450，CYP158A2（A2），它能夠生成非外消旋取代的BINOL產(chǎn)物，但產(chǎn)率較低且立體選擇性較差。

圖2. BINOL與A2-RhFRed變體（BinDR1-RhFRed）去消旋化的證據(jù)（圖片來源：Nature）

以此為起點，作者開展了定向進(jìn)化實驗，旨在提高交叉偶聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)率和對映選擇性（圖2a）。盡管BINOL中聯(lián)芳基鍵的旋轉(zhuǎn)勢壘很高，但已有多個報道表明，外部刺激尤其是氧化性金屬絡(luò)合物可以在室溫下誘導(dǎo)構(gòu)象不穩(wěn)定性，這是由于在阻轉(zhuǎn)異構(gòu)軸上發(fā)生錐形化所致（圖2b）。

為了確定哪些組分驅(qū)動了這種生物催化消旋化反應(yīng)，作者測試了每個元素的作用（圖3a）。在標(biāo)準(zhǔn)條件下，使用包含所有反應(yīng)組分的完整混合物（P450融合還原酶、NADPH循環(huán)系統(tǒng)、抗壞血酸鈉和氧氣）與rac-5反應(yīng)，以93:7的比例獲得了化合物5（圖3b）。在環(huán)境大氣條件下，使用 BinDR1和NaAsc進(jìn)行時間進(jìn)程分析，3小時后回收率為88%，對映體比例為 84:16。單獨(dú)使用過氧化物可使對映體比例迅速上升，隨后在反應(yīng)15分鐘后達(dá)到平臺期（圖3c）。這些實驗確定了這種化學(xué)驅(qū)動消旋化反應(yīng)的最小組分：P450 生物催化劑、氧氣和 NaAsc（抗壞血酸鈉）。無需傳統(tǒng)的NADPH再生系統(tǒng)或還原酶結(jié)構(gòu)域，簡化了反應(yīng)流程，提升了實用性。

圖3. 確定最小反應(yīng)條件集（圖片來源：Nature）

作者提出了一種循環(huán)消旋化反應(yīng)，其中氧化性P450物種生成立體不穩(wěn)定的苯氧基自由基中間體(I-5)（圖4b）。其關(guān)鍵步驟包括：氧化步驟：P450酶利用O?或H?O?氧化BINOL，生成苯氧自由基中間體。構(gòu)象翻轉(zhuǎn)：自由基中間體的旋轉(zhuǎn)能壘顯著降低（計算值為25.5 kcal/mol），使得其在室溫下可自由旋轉(zhuǎn)。手性選擇：酶的手性空腔選擇性識別并穩(wěn)定某一構(gòu)象的自由基中間體。還原步驟：NaAsc作為還原劑，將自由基中間體還原回閉殼層BINOL，恢復(fù)高旋轉(zhuǎn)能壘，鎖定目標(biāo)對映體。整個過程是氧化還原中性的，酶在反應(yīng)中不僅提供手性環(huán)境，還通過局部生成高活性自由基物種，實現(xiàn)了對構(gòu)象翻轉(zhuǎn)的精準(zhǔn)控制。

圖4. 對映富集的可能機(jī)理（圖片來源：Nature）

作者利用四種工程改造的P450變體（BinDR1至BinDR4）評估了該P(yáng)450介導(dǎo)的消旋化反應(yīng)在取代的BINOL衍生物上的合成應(yīng)用價值。這四種變體的選擇旨在對一系列取代的BINOL衍生物提供互補(bǔ)的選擇性（圖5）。圖5b描述了BinDR1至BinDR4與野生型酶的氨基酸取代差異。在NaAsc存在下，將消旋底物分別與每種P450-RhFRed進(jìn)行反應(yīng)。然后分析這些反應(yīng)的對映體比例（圖5c）和回收率（圖5d）。

在圖 5a 所示的條件下，BinDR1 將底物5富集至 88:12 的對映體比，回收率為 84%。該結(jié)果在制備規(guī)模上得到重復(fù)（88:12 的對映體比，分離產(chǎn)率為 79%）。

BinDR1和BinDR2變體對底物6–9表現(xiàn)出始終如一的高選擇性（BinDR1，對映體比為94:6至98:2）。這些底物在水中的溶解度較低，需要更高濃度的DMSO共溶劑才能觀察到消旋化。BinDR3表現(xiàn)出獨(dú)特的選擇性特征：對 3-鹵代底物（6–8）具有優(yōu)異的選擇性，但對3-甲氧基和3-苯基衍生物（9和10）的對映體富集度顯著降低。BinDR4是這些單取代BINOL選擇性最低的變體。

隨后，作者考察了對稱的3,3′-取代BINOL，以研究催化劑開發(fā)中常用修飾位點的空間位阻效應(yīng)。通常，對于3,3′-二鹵代BINOL（11–13），對映體富集度隨鹵素原子尺寸的增大而降低，這與單取代BINOL衍生物（6–10）的趨勢相反。BinDR4對底物11–13表現(xiàn)出最高的對映體富集度。

隨后，研究了C2對稱的BINOL（15–22），這些化合物可通過氧化偶聯(lián)反應(yīng)輕松外消旋化合成，但通常難以從市售的對映體純母體BINOL合成，尤其是在5,5′-和7,7′-位帶有取代基的情況下。BinDR1至BinDR3變體對5,5′-和6,6′-取代的BINOL（15–17；BinDR1：58:42–66:34）的選擇性較低，而BinDR4則表現(xiàn)出顯著更高的選擇性（92:8–95:5），表明這些變體具有互補(bǔ)的選擇性特征。這些結(jié)果表明，對映選擇性取決于底物取代和酶變體，并且可以通過選擇或改造合適的P450催化劑來定制消旋化反應(yīng)，使其適用于特定的聯(lián)芳基。

四種“通用型”BinDR變體表現(xiàn)出廣泛的活性和選擇性，但并非對所有底物都最優(yōu)，高對映體富集度在多輪進(jìn)化后有所提高（圖5e）。作者測試了更適合這些難處理底物的變體。對于7,7′-二甲氧基-BINOL (21)，一種新的變體BinDR5實現(xiàn)了79:21的對映體富集度，比BinDR1提高了13%。BinDR5與BinDR1共有四個突變位點（P45E、A83L、S181G 和 A245Q），但在另外四個位點上存在差異（BinDR1：R90Q 和 A290M；BinDR5：V74L 和 H183K）。對于 3,3′-二溴-BINOL (12)，BinDR6 將富集比從 28:72 (BinDR4) 提高到18:82；這一提升源于BinDR4中兩個突變位點（S181G 和 H183K）的恢復(fù)，同時保留了其他取代。這些發(fā)現(xiàn)表明，可以通過調(diào)控BinDR骨架來構(gòu)建特異性酶，從而顯著提高目標(biāo)底物的消旋化效率。

圖5. 底物范圍（圖片來源：Nature）

研究還發(fā)現(xiàn)，并非所有能催化氧化偶聯(lián)的P450酶都具備去消旋化能力。例如，真菌P450（KtnC）能高效催化對映選擇性偶聯(lián)，但不能實現(xiàn)去消旋化。這表明去消旋化是一種獨(dú)特的酶功能，而非所有P450的通用性質(zhì)。

總結(jié)

Alison R. H. Narayan教授課題組開發(fā)了一種用于富集對映體的BINOL衍生物的生物催化消旋化策略。這一意外發(fā)現(xiàn)提供了一種互補(bǔ)的、立體趨同的合成阻轉(zhuǎn)異構(gòu)體的方法，該方法依賴于可控的鍵旋轉(zhuǎn)而非鍵的形成，并且對多種BINOL骨架均有效。這項工作為酶促控制立體動力學(xué)過程提供了概念驗證，并凸顯了新型生物催化方法在控制傳統(tǒng)不對稱碳中心以外的立體化學(xué)方面的應(yīng)用前景。

文獻(xiàn)詳情：

Casey B. Roos, S. Luke Schulert, Lara E. Zetzsche, Spencer E. McMinn, Angela E. Cheong, Eunjae Shim, Eugene E. Kwan & Alison R. H. Narayan. Synthesis of enantioenriched atropisomers by biocatalytic deracemization.

Nature

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