研究發現：大和米蕈通過誘導細胞凋亡與抑制NF-κB通路作用鼠肝癌

肝癌是全球范圍內影響人數眾多的重大疾病。根據世界衛生組織（WHO）數據，原發性肝癌（即肝細胞癌HCC）位列全球癌癥死亡第三位。目前治療HCC最常用的是阿霉素、5-氟尿嘧啶和順鉑等化療藥物。然而這類全身化療方案對肝癌療效有限，且僅能縮小腫瘤的很小部分。因此，開發能精準打擊癌細胞、安全無毒的新品已成為業界迫切需求。

一項為期三年的臨床試驗針對HCC患者，旨在評估肝癌藥物與天然產物大和米蕈（MGN-3/Biobran）的聯合療效。研究表明，與單獨化療的患者相比，聯合治療能有效降低疾病復發率、提高生存率，并顯著降低甲胎蛋白水平。

大和米蕈（MGN-3/Biobran）作為無毒抗癌劑，其多種生物活性已得到長期研究驗證。在小鼠實驗中，它對實體埃利希癌和神經母細胞瘤表現出抗腫瘤活性，能增強放療引發的腫瘤消退效果，并強化低劑量紫杉醇對腫瘤細胞的凋亡作用。

在先前的初步研究中，科研人員發現大和米蕈（MGN-3/Biobran）對N-亞硝基二乙胺（NDEA）與四氯化碳（CCl 4）聯合作用引發的大鼠肝癌發生具有保護作用。具體而言，大和米蕈（MGN-3/Biobran）能逆轉這種致癌物對體重、肝臟重量及肝酶水平的負面影響。

本研究旨在探究大和米蕈（MGN-3/Biobran）對化學誘導大鼠肝癌發生保護作用的具體機制。科研人員重點考察了大和米蕈（MGN-3/Biobran）通過誘導肝癌細胞凋亡這一核心分子機制發揮保護作用，并評估了其通過抑制IkB-αmRNA表達及后續阻斷NF-κB信號通路產生的抗炎效應。

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材料和方法

1、大和米蕈（MGN-3/Biobran）

大和米蕈（MGN-3/Biobran）是一種由β1,3-葡聚糖和活性半纖維素組成的多糖。該制劑通過將米糠經香菇提取物酶解處理獲得。研究人員將新鮮配制的大和米蕈（MGN-3/Biobran）溶于0.9%生理鹽水后，以25毫克/千克體重/天的劑量每周五次通過腹腔注射，每次注射0.2毫升。

2、動物

本研究選用90只4月齡雄性Wistar大鼠（體重約120克），實驗動物購自埃及吉薩眼科研究所，實驗前經過一周適應期。大鼠單獨飼養于恒溫恒光（20±2℃）的籠舍中，每日喂食標準實驗室顆粒飼料。

3、肝癌發生誘導

研究人員通過腹腔注射給大鼠單次給予致癌化合物N-亞硝基二乙胺（NDEA）（200毫克/千克體重）。一周后，動物每周接受一次碳四氯化碳（CCl 4）（3 ml/kg體重）皮下注射，持續6周。

4、實驗設計

研究人員將90只大鼠隨機分為五個實驗組。

對照組（15只）作為未處理組。

第二組（15只）僅通過腹腔注射給予大和米蕈（MGN-3/Biobran）（25毫克/千克體重/天），每周注射五次。

第三組（20只）僅注射致癌物（NDEA+CCl 4）。

第四組（20只）從致癌物注射前兩周開始，每周五次給予大和米蕈（MGN-3/Biobran）（25毫克/千克體重/天），持續20周。

第五組（20只）從致癌物注射后第10周開始，每周五次給予大和米蕈（MGN-3/Biobran）（25毫克/千克體重/天），直至實驗結束。

具體時間安排詳見圖1。實驗期間持續監測體重變化（數據未展示）。

圖1：實驗方案示意圖。

5、樣本集

經過22周的實驗研究，實驗動物在使用乙醚麻醉前需禁食。研究人員首先對動物進行稱重，隨后實施解剖操作。從每只大鼠肝臟中取出組織樣本，用冰鹽水清洗后擦干并稱重。

肝組織檢測參數包括：組織病理學分析、細胞周期進程流式細胞術檢測、細胞凋亡分析、凋亡與細胞增殖相關蛋白調控因子（p53、Bax、Bcl-2、caspase-3及NF-κB/p65表達）的檢測，以及通過逆轉錄聚合酶鏈反應（RTPCR）測定p53、Bax、Bcl-2、caspase-3和IκB-α的相對基因表達水平。DNA損傷檢測采用凝膠電泳法，同時通過免疫染色法檢測NF-κB/p65表達。

6、組織病理學

為進行組織學處理，研究人員采集了不同組別的肝臟樣本。將組織切成小塊后立即置于10%中性福爾馬林緩沖液中固定24小時。固定完成后，樣本依次經過70%-95%濃度梯度乙醇脫水處理，隨后兩次更換為無水乙醇。

組織樣本經二甲苯透明化處理后，包埋于石蠟中。使用切片機制備4厚度為5μm的切片，載玻片固定后采用蘇木精-伊紅（H&E）染色法進行組織病理學觀察，并通過馬松三色染色法檢測膠原纖維。

7、流式細胞術研究：肝細胞制備

從不同組的肝臟中取出組織樣本，切成小塊，并用細尼龍紗布（40–50目/cm）輕輕擦拭。樣本用pH 7.5的Tris-乙二胺四乙酸（Tris-EDTA）緩沖液（3.029克0.1 M Tris-（羥甲基氨基甲烷）、1.022克0.07 M鹽酸和0.47克0.005 M Tris-EDTA）通過紗布洗滌。細胞懸浮于無菌PBS中，以1800轉/分鐘離心10分鐘，重懸于PBS（細胞密度約1×10 4個細胞/毫升），并用70%冰乙醇（與PBS混合）固定，保存于-20°C直至分析。

8、細胞周期分析

將肝細胞懸液離心后，取細胞沉淀重懸于1毫升碘化丙啶（PI）溶液中，避光孵育30分鐘。后續實驗采用流式細胞術進行檢測，數據通過MODFIT細胞分析軟件處理。

軟件會計算每個樣本中DNA細胞周期各階段（G0/G1、S期、G2/M期）的變異系數及細胞占比。當出現與G1期二倍體峰分離的明顯峰，且其與二倍體內部標準偏差超過10%；或G1峰與對應G2/M峰偏差超過10%時，則判定存在非整倍體細胞群。

9、細胞凋亡的定量測定

為定量檢測大和米蕈（MGN-3/Biobran）治療對肝癌細胞凋亡的影響，科研人員采用流式細胞術結合Annexin-V偶聯Alexafluor 488凋亡檢測試劑盒，嚴格按照說明書操作。

實驗中，早期凋亡細胞會呈現Alexa488熒光綠色，定位在熒光激活細胞分選直方圖的右下象限；晚期凋亡細胞則同時呈現Alexa488和碘化丙啶熒光，呈現紅綠色，位于直方圖的右上象限。

10、凋亡調節因子的流式細胞分析

本研究使用的凋亡相關蛋白小鼠抗體，包括p53抗體sc-7480、Bax抗體sc-7480、Bcl-2抗體sc-7382、caspase-3抗體sc-7272及NF-κB/p65抗體sc-8008。流式細胞檢測所用的二抗為熒光素（異硫氰酸熒光素，簡稱FITC）標記物。

11、凋亡調控因子及IκB-α基因的實時RT-PCR分析表達

凋亡調控因子的RT-PCR分析嚴格遵循制造商操作指南進行，總RNA提取采用GF-TR-050總RNA提取試劑盒。總RNA經FastQuant RT試劑盒逆轉錄生成cDNA，該試劑盒含gDNase酶，通過42℃孵育3分鐘去除基因組DNA，有效避免基因組DNA干擾。RT-PCR反應使用Maxima SYBR Green qPCR預混試劑（2×），反應條件與數據分析均按制造商說明書規范執行。

將μl ofcDNA加入25μl總體積的反應體系中，該體系包含12.5μl Maxima SYBR Green qPCR預混液（2×）、0.3μMol正向引物、0.3μMol反向引物（引物序列詳見表1）以及10 nM/100 nM ROX熒光染料溶液，并用無核酸酶水補足至25μl。

表1：RT-PCR所用引物序列。

12、凝膠電泳檢測DNA損傷

肝組織DNA提取采用天根基因組DNA試劑盒，嚴格按說明書操作。通過瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段（按堿基對長度區分），實現樣品可視化與純化。使用DNA分子量標準品測定片段長度，電泳完成后通過Gel Analyzer Pro v3.1凝膠分析系統自動檢測各泳道及條帶。

13、NF-κB/p65表達的免疫組化檢測

將肝組織切片置于帶正電荷的載玻片上，與抗NF-κB/p65小鼠單克隆抗體（貨號sc-8008）共同孵育。

采用鏈霉親和素-生物素法進行免疫組化染色，使用含10%非免疫血清、生物素化二抗及鏈霉親和素-過氧化物酶的Histostain-plus試劑盒。以DAB作為顯色劑，邁爾蘇木精作為復染劑。

隨后通過光學顯微鏡觀察載玻片，結果顯示NF-κB/p65在肝組織細胞質中表達，陽性NF-κB信號呈棕褐色。陽性細胞比例低于5%的切片判定為陰性。

結果

1、肝臟相對重量（RLW）

與對照組相比，暴露于致癌物（NDEA+CCl 4）的大鼠的RLW顯著增加。然而，無論是在致癌物暴露前還是暴露后給予大和米蕈（MGN-3/Biobran），RLW的增加均恢復正常，處于正常對照值范圍內（圖2）。

圖2：相對肝臟重量。每個數值代表相應動物組的平均值±SE：對照組（13）、單獨使用大和米蕈（MGN-3/Biobran）（13）、致癌物（15）、Biobran后致癌物（18）、致癌物后大和米蕈（MGN-3/Biobran）（17）。

2、細胞周期進程和細胞凋亡

本研究考察了致癌物與大和米蕈（MGN-3/Biobran）對正常肝細胞及腫瘤肝細胞不同細胞周期階段的影響。

表2數據顯示，在致癌物存在條件下，大和米蕈（MGN-3/Biobran）處理導致細胞周期停滯于亞G1期。與單獨使用致癌物的對照組相比，經預處理組的亞二倍體細胞比例顯著增加126%，經后處理組則增加99%（p<0.01）。

值得注意的是，致癌物處理組在使用大和米蕈（MGN-3/Biobran）后，雖未出現細胞周期停滯現象，卻導致腫瘤細胞周期狀態（G0/G1、S期及G2/M期）發生紊亂。

表2：各組肝臟組織的細胞周期進程與凋亡情況。每個數值代表6只大鼠/組的平均值±標準誤。

3、AnnexinV/PI染色法定量檢測細胞凋亡

表3數據顯示，與未處理的致癌物組相比，經大和米蕈（MGN-3/Biobran）預處理或后處理的致癌物組早期凋亡細胞比例分別顯著增加316%和309%（p<0.01）。

晚期凋亡細胞比例在致癌物+大和米蕈（MGN-3/Biobran）組中顯著增加237%（p<0.01），而大和米蕈（MGN-3/Biobran）預處理組【致癌物+大和米蕈（MGN-3/Biobran）】的晚期凋亡細胞比例增幅更大，達到255%（p<0.01），明顯高于未處理組。

表3：通過Annexin V/PI雙染色法對不同組別肝臟組織的細胞凋亡進行流式細胞術分析。各組數據均以6只大鼠的平均值±標準誤表示。

4、凋亡調節因子的流式細胞分析

通過流式細胞術檢測了致癌物和大和米蕈（MGN-3/Biobran）對正常肝細胞與腫瘤細胞凋亡調控因子表達百分比的影響。

表4結果顯示，大和米蕈（MGN-3/Biobran）在體內通過線粒體依賴性通路誘導肝癌細胞凋亡，且預處理效果顯著優于后處理：

p53表達量分別增加107%和77%，Bax表達量分別增加129%和108%，Bcl-2表達量分別降低48%和51%，Bax表達量分別增加129%和108%，Bcl-2表達量分別降低48%和51%，Bcl-2表達量分別降低48%和51%，Bcl-2表達量分別降低48%和51%。

表4：不同組別肝臟組織中凋亡調控因子的流式細胞術分析。每個數值代表6個肝臟樣本/組的平均值±標準誤。

5、凋亡調節因子的相對基因表達

科研人員采用RT-PCR技術檢測了致癌物與大和米蕈（MGN-3/Biobran）對不同實驗組肝臟組織中凋亡調控基因相對表達水平的影響。

如表5所示，未處理的致癌物組中p53、Bax和caspase-3基因表達水平較低，而Bcl-2基因表達水平較高。經大和米蕈（MGN-3/Biobran）預處理后，與未處理組相比，p53、Bax和caspase-3基因表達分別顯著上調143%、80%和96.71%（p<0.01），Bcl-2基因表達水平則下降53%。同樣地，大和米蕈（MGN-3/Biobran）后處理組在p53、Bax和caspase-3基因表達方面也顯示出顯著上調（p<0.01），但Bcl-2基因表達水平的下調幅度較小。

表5：本研究通過RT-PCR技術檢測不同處理對大鼠肝臟組織中p53、Bax、Bcl-2和caspase-3基因相對表達的影響。以GAPDH作為內參基因進行定量分析，數據以對照組為基準，以百分比形式呈現表達量變化。正常對照組的相對基因表達量設定為1，各組數據均代表5個肝臟樣本的平均值±標準誤。

6、NF-κB/p65表達的流式細胞術與免疫組化檢測

流式細胞術檢測顯示，與未處理的致癌物組相比，經大和米蕈（MGN-3/Biobran）預處理組和后處理組的肝細胞中NF-κB/p65蛋白水平分別顯著下調46.08%和38.87%（圖3A）。對對照組和大和米蕈（MGN-3/Biobran）處理組大鼠肝組織進行免疫組化分析發現，肝細胞胞質中NF-κB/p65均呈陰性表達。致癌物處理組的肝組織。

經大和米蕈（MGN-3/Biobran）處理的大鼠在炎癥和纖維化區域表現出強烈的細胞質NF-κB/p65免疫反應活性。大和米蕈（MGN-3/Biobran）處理降低了細胞質NF-κB/p65的表達，在少數肝細胞中顯示弱陽性免疫反應活性，處理前為陰性，處理后為輕度陽性（圖3 B）。

圖3：(A)流式細胞術檢測各組肝臟組織中NF-κB/p65的表達水平。每個數值代表6個肝臟樣本/組的平均值±標準誤。(B)NF-κB/p65在肝臟組織中的免疫組化檢測結果。

7、IκB-α的相對基因表達

圖4通過RT-PCR技術展示了不同組別肝臟組織中IκB-α基因表達的定量檢測結果。單獨使用大和米蕈（MGN-3/Biobran）處理的動物，其IκB-α基因表達水平與正常對照組相比未見顯著變化。

當向大鼠注射致癌物后，IκB-α基因表達水平顯著下降（p<0.01），降至0.53±0.03。在致癌物注射前兩周開始并持續整個實驗周期的大和米蕈（MGN-3/Biobran）給藥，成功逆轉了IκB-α基因表達的下降趨勢，與未處理組相比實現了131%的顯著上調。

值得注意的是，與未處理組相比，大和米蕈（MGN-3/Biobran）的后期給藥可抵消致癌物對IκB-α基因表達的抑制作用，使其表達水平回升76.57%。

圖4：通過RT-PCR測定不同處理對大鼠肝臟組織中IκB-α基因相對表達的影響。每個數值代表5個腫瘤樣本/組的平均值±SE。a，與對照組相比，p<0.05，p<0.01，分別具有顯著差異。b，與大和米蕈（MGN-3/Biobran）組相比，p<0.05，p<0.01分別具有顯著差異。c，與致癌物組相比，p<0.05，p<0.01水平上顯著不同。d，與大和米蕈（MGN-3/Biobran）組相比，Carcinogen組在p<0.05水平上存在顯著差異。

8、凝膠電泳檢測DNA損傷

通過凝膠電泳技術檢測不同處理組肝臟組織的細胞核DNA片段化情況，并使用Image J軟件進行圖像分析。DNA瓊脂糖凝膠電泳是檢測細胞凋亡的特異性方法，其特征性DNA梯狀圖譜可作為凋亡標志。

圖5：采用Image J軟件對大鼠肝臟組織進行凝膠電泳分析后獲得的DNA片段化百分比。數據為3次不同凝膠電泳運行的平均值±標準誤。

9、肝臟病理學

致癌物在大鼠肝臟中誘發了多種增殖性病變和癌前病變。圖6（左垂直面板A-E）展示了肝臟病理學數據。正常對照組肝臟未見異常(A)。大和米蕈（MGN-3/Biobran）處理組大鼠的肝切片顯示肝臟結構正常(B)。

致癌物處理組出現肝臟結構破壞，形成由纖維隔分隔的增生性結節，伴有浸潤性炎性細胞和膽管增生。致癌物處理引發脂肪變性，特征包括無區域分布的大小液滴狀巨泡性脂肪變性、局灶性肝細胞胞漿空泡化、核形態異型及頻繁的有絲分裂活動(C)。

在注射亞硝胺前使用大和米蕈（MGN-3/Biobran）處理組未出現脂肪變性，肝臟結構完整，僅存在輕微核改變和炎癥反應(D)。亞硝胺注射后使用大和米蕈（MGN-3/Biobran）處理組脂肪變性減輕，僅可見少量脂滴（LD），并伴有中度門靜脈炎癥浸潤（以淋巴細胞為主）及少量肝細胞變性(E)。

肝纖維化導致肝臟結構異常(H)。另一方面，預先用大和米蕈（MGN-3/Biobran）處理的動物肝臟組織顯示，癌物處理組的中心靜脈周圍僅有少量膠原纖維沉積，表明大和米蕈（MGN-3/Biobran）能有效防止肝臟進行性纖維化(I)。與僅用癌物處理的動物相比，接受大和米蕈（MGN-3/Biobran）后處理的動物在充血的中心靜脈周圍也顯示出中等程度的膠原纖維沉積(J)。

圖6：左側垂直面板展示經H&染色的肝臟切片代表性顯微照片

結論

科研人員得出結論：大和米蕈（MGN-3/Biobran）能夠通過誘導細胞凋亡、抑制炎癥反應和癌細胞增殖，有效阻斷致癌物（NDEA與CCl 4聯合使用）引發的肝癌發生。

肝臟組織的分子機制研究表明，大和米蕈（MGN-3/Biobran）可逆轉致癌物對IκB-α（IκB-α）基因表達的抑制作用，下調核因子κB（NF-κB/p65）和Bcl-2的表達水平，同時上調p53、Bax及caspase-3的基因表達量和蛋白水平，并增強基于核DNA片段化的細胞凋亡過程。

這些發現表明，大和米蕈（MGN-3/Biobran）有望成為預防和治療肝癌發生的新型化學預防劑和化療藥物。

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