精準病理新方向，從IHC到mIHC，伴隨診斷正邁入空間病理學時代！

伴隨診斷技術正經(jīng)歷從傳統(tǒng)免疫組化（IHC）向多重熒光免疫組化（mIHC）的革命性跨越，這一變革深刻反映了精準醫(yī)療時代對腫瘤微環(huán)境多維解析的迫切需求。

在之前的精準病理系列文章中，我們圍繞Claudin18.2、MET、ALK、FRα、MAGE-A4、MMR、PD-L1、HER2等多個核心蛋白靶標，詳細拆解了免疫組化（IHC）技術在精準病理伴隨診斷中的核心價值，為醫(yī)生制定治療方案提供了關鍵依據(jù)。

然而，隨著對腫瘤微環(huán)境認識的不斷深入，單一蛋白靶標分析的局限性日益凸顯，無法全面揭示疾病的復雜病理生理狀態(tài)。因此，多重熒光免疫組化（mIHC）技術應運而生，它可以在一張組織切片上進行多個蛋白靶標染色，通過各靶標在細胞上的單表達或共表達，識別不同細胞亞群的空間關系，正逐步成為伴隨診斷領域的新寵。

▲ IHC單重染色 vs. mIHC多重染色

今天，我們來聊聊伴隨診斷技術從IHC到mIHC的進化之路。

01

IHC臨床價值與固有局限

IHC技術自問世以來，憑借其操作簡便、結果直觀且可靠的特點，在腫瘤病理診斷中占據(jù)了不可替代的地位。它通過抗原-抗體特異性結合的原理，能夠在組織切片上精準定位目標蛋白，為腫瘤分型、預后評估及治療選擇提供了重要依據(jù)。

IHC技術成功地將眾多生物標志物，如Claudin18.2、MET、ALK、FRα、MAGE-A4、MMR、PD-L1、HER2等，從實驗室推向了臨床常規(guī)檢測，成為伴隨診斷的基石。

然而，IHC的局限性也顯而易見：單次檢測僅能標記一個蛋白靶標，難以全面反映腫瘤微環(huán)境中多種蛋白質之間的相互作用和空間關系。腫瘤微環(huán)境猶如一個高度復雜且精密的生態(tài)系統(tǒng)，其復雜性遠非單個蛋白表達所能涵蓋。例如，要評估免疫治療的真實潛力，我們需要同時了解多個蛋白標志物的復雜表達模式，如腫瘤細胞上的PD-L1表達、周圍浸潤免疫細胞（如CD8+ T細胞等）的數(shù)量、定位及其功能狀態(tài)。

值得注意的是，IHC可雙染，即對同一組織切片進行兩種不同標志物的染色，然后通過視覺評估。通常，DAB（棕色）顯色劑用于標記一個蛋白靶標，萘酚/快紅（或其他紅色顯色劑）用于標記另一個蛋白靶標。因此，IHC雙染我們也常稱之為明場mIHC。IHC雙染的局限性在于，需選擇不同種屬一抗，且當顯色劑在同一共定位的細胞區(qū)室中重疊時，很難確定是否存在雙重標記，因為吸光顯色劑會結合形成顏色不確定的暗信號。最重要的是，與熒光染料相比，明場顯色劑相對較少且吸收光譜比熒光基團更寬，這也意味著明場多重很容易光譜重疊和串色。

因此，傳統(tǒng)IHC若要檢測多種蛋白標志物，往往需通過連續(xù)切片重復染色流程。這不僅造成組織樣本的浪費，更關鍵的是無法捕捉蛋白的原位空間關聯(lián)——如同我們僅能看到散落各處的拼圖碎片，始終無法拼湊出完整的疾病全貌。該局限性在免疫治療、靶向治療耐藥機制研究中尤為顯著，也使得伴隨診斷技術的升級迭代迫在眉睫。

▲ 傳統(tǒng)單重IHC無法在一張切片上同步展示多維信息

02

mIHC開啟空間蛋白解析時代

多重熒光免疫組化（mIHC）正在悄然改變游戲規(guī)則。如果說IHC是病理診斷的『單點探測儀』，那mIHC就是『全景雷達』。

▲ mIHC開啟空間蛋白解析新時代

作為IHC技術的進階形態(tài)，mIHC最主（成）流（熟）技術是通過酪胺信號放大（TSA）原理（即利用辣根過氧化酶HRP標記的二抗與一抗結合，HRP在過氧化氫環(huán)境下催化激活熒光標記的酪胺分子，使熒光底物與抗原表位酪氨酸殘基共價結合形成大量熒光信號），使用多色熒光標記不同抗體（每個熒光染料都有自己特定的發(fā)射光譜），能在同一張組織切片上同時檢測多種生物標志物，清晰呈現(xiàn)它們的空間分布和相互作用關系。因此，mIHC（TSA）也常稱之為熒光場mIHC。

▲ mIHC技術原理（對比IHC技術）

▲ mIHC TSA放大機制

▲ mIHC多重染色效果圖

這一技術突破，不僅大大提高了檢測效率，更通過保留空間位置信息，揭示了腫瘤微環(huán)境中細胞間的復雜相互作用。簡言之，mIHC與單重IHC的主要區(qū)別在于，能夠檢測和區(qū)分組織結構背景中的多個蛋白質靶標，同時不丟失形態(tài)或空間信息。

mIHC相較于IHC的優(yōu)勢有：

? 突破一抗種屬限制問題；

? 減少組織樣本消耗（特別是小活檢/稀有樣本）；

? 原位實現(xiàn)多蛋白共檢和共定位，保留空間信息；

? 揭示細胞間相互作用、組織結構和功能狀態(tài)；

? TSA放大，可提高低豐度蛋白的檢測靈敏度；

? IHC為半定量分析，mIHC可精準定量分析；

? mIHC比多輪IHC更具成本效益和時間效率，減少試劑及實驗室資源的消耗。

綜合而言，mIHC可以解決許多科學問題，包括臨床、轉化和基礎研究應用。這一技術有望在伴隨診斷開發(fā)中占據(jù)重要地位。

03

mIHC在藥物臨床試驗中的應用

盡管目前尚未有用于多重生物標志物檢測的mIHC伴隨診斷產(chǎn)品獲批，但全球范圍內(nèi)的臨床試驗和企業(yè)合作，正在為其伴隨診斷落地應用鋪路。

近年來，mIHC技術在藥物臨床試驗中的應用日益廣泛，成為評估藥物療效和預測患者反應的重要工具。目前，美國國家癌癥研究所（NCI）將其納入腫瘤免疫療法臨床試驗指南（CIMACs-CIDC），全球頂尖藥企也紛紛采用該技術推進創(chuàng)新療法與伴隨診斷產(chǎn)品研發(fā)。

以Akoya Biosciences（現(xiàn)被Quanterix收購）為例，該公司與多家藥企合作，利用其先進的mIHC技術平臺，開展了多項靶向/免疫藥物的臨床試驗。其中，最重要的進展是在2022年6月28日，Akoya Biosciences與Acrivon Therapeutics宣布合作，共同開發(fā)、驗證和商業(yè)化Acrivon的OncoSignature測試（這是一款基于mIHC技術所開發(fā)的前所未有的伴隨診斷產(chǎn)品），該測試將用于識別對CHK1/2抑制劑ACR-368治療最有可能產(chǎn)生反應的癌癥患者。

▲ Akoya與Acrivon合作開發(fā)首個mIHC伴隨診斷產(chǎn)品

2023年11月28日，美國FDA授予了ACR-368 OncoSignature測試的突破性設備認證，這是一款用于識別可能從ACR-368治療中受益的卵巢癌患者的mIHC檢測產(chǎn)品，也是mIHC產(chǎn)品首次獲得FDA的突破性醫(yī)療器械認證。

2025年2月5日，美國FDA授予了ACR-368 OncoSignature測試的突破性醫(yī)療器械認證，這是FDA第二次認定，用于識別可能從ACR-368治療中受益的子宮內(nèi)膜癌患者。該認定也反映了FDA的判斷，即該設備有望為危及生命或造成不可逆轉的削弱人類健康狀況的疾病或狀況提供更有效的治療或診斷。

▲ OncoSignature測試：基于mIHC技術所開發(fā)的多種生物標志物檢測產(chǎn)品，對FFPE樣本的多色圖像定量分析，如果所有3個生物標志物評分都高于預定閾值，則樣品被確定為OncoSignature陽性。

目前來看，若ACR-368藥物和ACR-368 OncoSignature Assay一旦同步獲批，mIHC技術將迎來臨床應用爆發(fā)點。

mIHC正逐步成為伴隨診斷領域的新寵。

當前，行業(yè)內(nèi)對于mIHC panel的檢測，若panel檢測≤9色，則稱之為多重檢測；若panel檢測>9色，則稱之為超多重檢測。一項HPK1抑制劑NDI-101150（臨床前數(shù)據(jù)顯示，HPK1抑制劑即使在免疫抑制條件下也可能激活T細胞、B細胞和樹突狀細胞的抗腫瘤活性）的臨床試驗中使用了『多重+超多重』的檢測方法：2重（CD3, pSLP76）+12重（Ki67, GrzB, Lag3, CD8, PD-1, FoxP3, CD11c, CD3, CD4, CD20, pan-CK），對治療前和治療后患者的4um厚FFPE樣本進行mIHC檢測評估。

研究發(fā)現(xiàn)：1）腫瘤活檢mIHC證實治療期間pSLP76的抑制；2）通過mIHC 12重組織免疫表型分析觀察到的CD8+ T細胞招募和激活增強，支持了NDI-101150通過調節(jié)腫瘤免疫微環(huán)境發(fā)揮作用的假設。

▲ HPK1抑制劑：mIHC多重+超多重的臨床試驗

此外，mIHC技術還可以在單張切片上同時實現(xiàn)蛋白和RNA共檢，如單RNA檢測或RNAscope等。

目前，有上百項關鍵臨床試驗中采用了mIHC的空間蛋白組學技術，也表明了空間特征可作為預后和預測治療獲益的指標。預計在近1-2年內(nèi)，mIHC臨床試驗將從小型探索性研究向大規(guī)模注冊研究過渡，最終走向臨床應用。

04

mIHC技術已就位，未來正當時

2025年12月19日，國家醫(yī)保局印發(fā)《病理類醫(yī)療服務價格項目立項指南（試行）》，其中28項指南明確三項可加收項，第20項特別指出：。這一舉措，無疑是國家醫(yī)保局對mIHC項目加收的明確支持，一次檢測鎖定多個靶點，為精準醫(yī)療筑牢堅實保障。

▲ 國家醫(yī)保局：IHC檢測可以加收多重染色

其實，這一政策出臺早有端倪。早在2023年9月28日，國家衛(wèi)健委、國家中醫(yī)藥局和國家疾病預防控制中心三大權威機構聯(lián)合發(fā)布《全國醫(yī)療服務項目技術規(guī)范（2023年版）》，將『多色免疫熒光檢測』及『數(shù)字化熒光病理切片掃描』正式納入國家級醫(yī)療服務收費項目名單。這不僅代表著國家主管部門對mIHC臨床價值的高度認可，更為各省市申請mIHC收費提供了有力依據(jù)。

此次醫(yī)保局指南進一步明確加收政策，形成政策閉環(huán)，標志著mIHC行業(yè)進入規(guī)范化發(fā)展快車道。

政策東風下，提前布局mIHC全產(chǎn)業(yè)鏈、手握核心產(chǎn)品注冊證（包括多色顯色試劑盒，全自動免疫組化染色機，多光譜數(shù)字病理掃描儀/熒光明場多功能數(shù)字病理掃描儀和mIHC智能分析軟件）的企業(yè)將率先搶占先機。

隨著技術的不斷進步和成本的逐步降低，mIHC技術有望在伴隨診斷領域得到更廣泛的應用。未來，mIHC技術將不僅僅局限于腫瘤治療領域，還將拓展至自身免疫性疾病、神經(jīng)退行性疾病等多個領域。同時，隨著人工智能和大數(shù)據(jù)技術的融入，mIHC技術將實現(xiàn)更高水平的自動化和智能化分析，為精準醫(yī)療的發(fā)展注入新的動力。

從IHC到mIHC，伴隨診斷技術正經(jīng)歷著從單分子分析到多維度、空間定位分析的深刻變革。mIHC技術以其獨特的優(yōu)勢，正在逐步成為腫瘤精準治療的重要工具。未來，隨著技術的不斷完善和應用場景的拓展，mIHC技術將為更多患者帶來福音，開啟精準醫(yī)療的新篇章。

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