神經環路應用（39）丨如何在體精準調控神經環路基因？

案例簡要解析

CRISPR activation for SCN2A-related neurodevelopmental disorders

背景

SCN2A基因編碼鈉通道Nav1.2，與神經發育和神經興奮性密切相關。SCN2A單倍體不足會導致神經環路興奮性異常，引發自閉癥譜系障礙和癲癇等疾病。傳統基因治療難以精準上調剩余野生型等位基因表達，需要開發新型治療策略。

技術原理

采用CRISPR激活系統，通過dCas9-VP64融合蛋白靶向SCN2A基因啟動子區域，利用經篩選驗證的sgRNA-（位于轉錄起始位點上游81 bp）實現高特異性結合，在有效激活基因表達的同時最大限度降低脫靶風險。為確保高效遞送與穩定表達，分別構建了AAV-DJ-saCas9-VP64和AAV-DJ-sgRNA兩種腺相關病毒載體，通過優化血清型（AAV-DJ）提升轉導效率和組織特異性，從而在目標腦區實現協同、持久的SCN2A轉錄激活。

實驗設計

采用多層面策略系統評估基因編輯干預的效果：首先在體外利用Neuro-2a細胞系進行sgRNA轉染并通過qPCR篩選出敲低效率最高的sgRNA；隨后在體內使用SCN2A+/-雜合子小鼠模型，從出生后30天（P30）開始實驗。為實現高效靶向遞送，分別采用腦內立體定位注射將CRISPR組件精準導入內側前額葉皮層（mPFC），以及通過靜脈注射系統性給予具有血腦屏障穿透能力的AAV-PHP.eB載體。

干預效果通過多層次指標綜合評估包括：mPFC神經元的電生理特性、鈣成像記錄的神經活動動態、焦慮/認知等相關行為學表現以及目標基因表達水平等分子生物學檢測。

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關鍵步驟

首先進行載體構建，將催化失活的saCas9與轉錄激活結構域VP64融合形成saCas9-VP64表達元件，并針對SCN2A啟動子區域（位于轉錄起始位點上游?81 bp）設計并優化sgRNA序列（sgRNA-），以確保高特異性結合并降低脫靶風險。隨后，將saCas9-VP64和sgRNA分別包裝入AAV-DJ血清型腺相關病毒載體，經純化后測定病毒滴度，確保≥1×1013 GC/mL以滿足高效中樞遞送需求。

在動物實驗階段，對SCN2A?/?小鼠于P30開始實施立體定位手術，以100 nL/min的恒定流速緩慢注射病毒混合液至mPFC，避免組織損傷并促進局部表達。

術后3–4周依次開展多模態功能檢測：

取腦片進行全細胞膜片鉗記錄，分析動作電位（AP）基本特性及鈉電流密度：可評估SCN2A激活是否在單個神經元水平恢復了電壓門控鈉通道的功能，可定量驗證基因激活是否在電生理層面實現功能挽救。

利用雙光子顯微鏡對mPFC神經元進行活體鈣成像，采集自發或誘發活動下的ΔF/F信號：可在局部神經環路層面觀察神經元群體活動是否恢復正常。

同時結合社交行為測試和PTZ誘導癲癇模型，評估環路功能恢復對整體行為的影響：從整體動物行為層面驗證干預的治療意義。

Fig1 青春期小鼠Scn2a單倍體不足的基因修復

技術創新點

• 精準激活：僅靶向剩余野生型等位基因避免基因編輯風險；

• 雙模式遞送：局部腦注射+全身靜脈注射適應不同研究需求；

• 跨物種驗證：小鼠模型+人源iPSC神經元增強臨床相關性；

• 實時檢測：電生理-鈣成像-行為學閉環驗證確保功能挽救。

文獻引用

• Tamura, S., Nelson, A.D., Spratt, P.W.E. et al. CRISPR activation for SCN2A-related neurodevelopmental disorders. Nature 646, 983–991 (2025). https://doi.org/10.1038/s41586-025-09522-w

• Nelson, A. D. et al. Physical and functional convergence of the autism risk genes Scn2a and Ank2 in neocortical pyramidal cell dendrites. Neuron 112, 1133–1149 (2024).

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