【必備技能】TLC薄層層析技術

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薄層色譜，或稱薄層層析(thin-layer chromatography)，是以涂布于支持板上的支持物作為固定相，以合適的溶劑為流動相，對混合樣品進行定性與定量分析、分離和鑒定的一種層析分離技術。20世紀50年代從經典柱色譜法及紙色譜法的基礎上發展起來的一種平面色譜技術;至20世紀60年代后，人們對薄層色譜法在使用器材的規格、操作方法及術語使用的標準化等方面進行了大量的工作，使該方法日趨成熟和完善，廣泛地應用于有機合成中。TLC薄層層析技術作為有機合成中，最直接的監測反應的手段，本文對其內容進行簡單的介紹。

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原理:色譜法的基本原理是利用混合物中各組分在某一物質中的吸附或溶解性能的不同，或和其它親和作用性能的差異，使混合物的溶液流經該種物質，進行反復的吸附或分配等作用，從而將各組份分開。

特點:樣品分離量少(微克~毫克級)，分析快速。

分類:按所用固定相材料不同，分為吸附、分配、離子交換、凝膠過濾等薄層層析。有機合成中常用的硅膠，氧化鋁薄層屬于吸附色譜。

比移值（Rf）：化合物移動的距離大小用Rf值來表達。這是一個位于0～1之間的數值，它的定義為：化合物最高濃度中心距離原點基線（最先點樣時已經確定）的距離除以溶劑的前沿距離原點基線的距離。

點樣----成功分離的關鍵

1、點樣原點小而圓，直徑盡量不要超過2mm（有機溶劑盡量用0.3mm直徑毛細管，水等高粘度的溶劑用0.5mm直徑的）;

2、在便于顯色的前提下，點樣量盡量少，防止過載拖尾或掩蓋Rf相近的點;

3、點樣勿傷及薄層表面;

4、點樣原點盡量遠離薄層邊緣，至少相隔3mm, 減少邊緣效應（邊緣經常跑歪）;

5、選擇規則的矩形薄板;

6、所有點樣點要保持在一條與底邊平行的直線上，標準點對照時，務必點交叉點；

7、點樣完后，溶劑用電吹風盡量吹干。

展開劑的選擇：化合物在薄板上移動距離的多少取決于所選取的溶劑不同。在戊烷和己烷等非極性溶劑中，大多數極性物質不會移動，但是非極性化合物會在薄板上移動一定距離。相反，極性溶劑通常會將非極性的化合物推到溶劑的前段而將極性化合物推離基線。一個好的溶劑體系應該使混合物中所有的化合物都離開基線，但并不使所有化合物都到達溶劑前端，Rf值最好在0.2~0.8之間。雖然這個條件不一定都能滿足，但這應該作為薄層色譜分析的目標（在柱色譜中，合適的溶劑應該滿足Rf在0.2~0.3之間）。那么，應該選取哪些溶劑呢？一些標準溶劑和他們的相對極性列于如下：【】

常用展開體系極性大小順序

石油醚 <正己烷<二氯甲烷<四氫呋喃<乙酸乙酯<丙酮<正丙醇<甲醇<水< pan>

常用的混合體系

EA/PE(hexanes)，DCM/MeOH

PE/DCM，PE/Acetone，Ether/DCM，EA/DCM，Acetone/DCM

展開劑的選擇原則

1、對所需成分有良好的溶解性;

2、可使各成分間有較好的分離；

3、待測組分的Rf在0.2~0.8之間；

4、不與待測組分發生化學反應;

5、沸點適中，黏度較小;

6、展開后組分斑點圓且集中;

7、混合溶劑最好新鮮配制。

展開：

1、盡量用新配制展開劑(長時間揮發后比例會改變);

2、展開缸蓋子密封性要好;

3、展開劑用量適中，不能漫過點樣原點;

4、薄層板側邊不能貼到展開缸壁;

5、薄層板盡量用鑷子夾住小心放入展開缸中，而不是用手捏住放入;

6、讓溶劑向上展開約90%的薄板長度；

7、理想的展開位置為保證Rf值在0.2~0.8之內。

看板----一看、二照、三碘、四顯

1、從展開池中取出薄板并且馬上用鉛筆標注出溶劑到達的前沿位置, 根據這個計算Rf的數值;

2、用鑷子小心取出薄層板，吹千溶劑;

3、首先直接觀察，畫出有色物質的斑點位置;

4、在紫外燈下觀察有無暗斑或熒光斑點（并用鉛筆畫出斑點位置）;

5、大部分有機物會吸附碘，可逆的產生棕色或黃色斑點;

6、千萬注意，等高的點，不一定是同一個物質，有可能是極性相同的點，需要用其他監測方法（如LCMS）確定。

7、用破壞性方式觀測薄板。當化合物沒有紫外活性的時候，只能采用這種方法。在【】中，提供了很多非常有用的染色劑。使用染色劑時，將干燥的薄板用鑷子夾起并放入染色劑中，確保從基線到溶劑前沿都被浸沒。用紙巾擦干薄板的背面。將薄板放在加熱板上觀察斑點的變化。在斑點變得可見而且背景顏色未能遮蓋住斑點之前，將薄板從加熱板上取下。

TLC-MS聯用

用小板點成帶狀，分離少量的樣品，刮取a、b、c三個純點，MS檢測出哪個點可能是我們的產物，取得標樣，再展開prep-TLC得到純化后樣品，作 NMR鑒定。

TLC監測反應時機:對于不穩定的化合物各個時機點最好都要監測。

1、反應半小時;

2、反應過夜前后，TLC檢測并留樣:

3、后處理前后，TLC檢測并留樣;

4、樣品拌硅膠前后，TLC檢測并留樣;

5、機分樣品濃縮凍干前后，TLC檢測并留樣。

TLC為柱分離尋找條件

1、選擇不同的混合體系, 多次嘗試，如果想讓Rf變得更大一些，可使溶劑體系極性更強些；如果想讓Rf變小，就應該使溶劑體系的極性減小些。如果在薄板上點樣變成了條紋狀而不是一個圓圈狀，那么你的樣品濃度可能太高了。稀釋樣品后再進行一次薄板層析，如果還是不能奏效，就應該考慮換一種溶劑體系。

2、找到目標物Rf值0.2左右，并與其他雜質分離度較大的系統;

3、然后根據樣品分離度，硅膠規格，柱徑比，硅膠與樣品比例等綜合信

息，選擇比Rf值0.2左右體系稍小極性的體系進行柱層析。

Prep-TLC分離樣品：具體請看往期文章【】

樣品要求：因為硅膠板是弱酸性的，對酸不穩定的化合物盡量避免爬大板；對空氣，水，有機溶劑穩定； 低沸點的溶劑里要好溶；最好有紫外吸收；極性不能太大（至少展開劑能爬起來）。

上樣：盡量少的溶劑溶解樣品，最好是易揮發的，二氯甲烷最常用，如果不溶可以加幾滴甲醇促溶。可以用一次性滴管塞棉花后剪成毛筆狀上樣，每個人的辦法都不同，小編就是這么弄的，順便練練毛筆字。上樣時也最好像寫毛筆字一樣一氣呵成，這樣跑出來的帶比較均勻。如樣品溶液太多需要上兩遍樣，先用吹風機吹干溶劑后再上樣。

跑板：展開劑的選擇，先用小板爬樣，具體怎么爬小板，選到合適的展開劑后，配好溶劑爬大板，由于大板和小板由細微的差別，大板展開劑的極性可以稍微比小板展開劑的極性大一點，一樣的話也問題不大。跑板最好要跑到快頂端1cm左右，充分展開樣品，切記不要跑過，跑過的話，極性小的點可能會被展開劑沖都一起，而極性大的點雖然不會沖到上面，但會變散，不容易判斷色帶的邊緣。

檢測：產品的判斷，通過極性大致判斷哪幾個色帶可能是產品，然后每個色帶可以先刮一點，碾碎，加甲醇溶解，過濾送LCMS檢測判斷。

刮板：判斷好色帶后，在紫外燈下，用鉛筆描好熒光帶，開始刮板。帶好口罩很重要，小編是用美工刀刮的，刮不干凈的可以用小板刮可以刮干凈。

洗脫：刮好的硅膠，量少的話，可以隔著稱量紙用試管搟碎。量多的話，直接裝到自封袋里面隨便蹂躪，直到成粉末為止。粉末狀的硅膠樣品的洗脫，大部分人是直接加溶劑泡出來。但小編用的是，把硅膠粉直接裝到柱子（有底層砂芯的那種）里，上層鋪一薄薄的石英砂，直接像過柱子一樣在上層加溶劑壓出來，這種方法的好處就是，對于溶解性不好的樣品可以快速洗出，用相對較少的溶劑洗出產品。加入溶劑洗脫的時候可以隨時點板看產品是否已經完全洗出。

常見拖尾原因及解決辦法

1、首先考慮的是樣品濃度過大，薄層板過載導致。這種情況直接降低樣品濃度或者是上樣量就可以驗證了。
2、樣品對硅膠的吸附能力過強導致的拖尾。對不同體系加入不同的調節劑，酸體系加冰醋酸或甲酸，堿體系加氨水、三乙胺或二乙胺。
3、展開劑的極性與樣品極性不附，不能做到有效展開導致?？梢酝ㄟ^調節展開劑極性解決。
4、如果是長帶狀，那最可能的原因是展開劑對樣品的溶解度不夠所導致?？梢愿鶕O性表換極性相近的對樣品溶解度更好的溶劑做展開劑，另外樣品未溶解完全，點在班上的樣品有未溶固體樣品也會導致長條狀拖尾。

【參考相關文章：】

TLC顯色劑匯總

4-甲氧基苯甲醛顯色 (廣譜顯色劑)

原料 ：
1. 4-甲氧基苯甲醛 (p-anisaldehyde) 13mL
2. 醋酸 (AcOH) 5mL
3. 濃硫酸 (conc. H2SO4) 18mL
4. 乙醇 (EtOH) 478mL

調配方法： 把1,2,4在冰浴條件下混合后，緩慢滴加3，冷藏保存。

磷鉬酸顯色劑 (廣譜顯色劑，特別是含有羥基的化合物)

原料：
1. 磷鉬酸 (12MoO3.H3PO4) 5g
2. 乙醇 (EtOH) 100mL

調配方法： 把1,2混合成溶液

注意：需要強熱才能顯色

鈰 – 鉬酸銨顯色 別名：HANESSIAN染色液(廣譜顯色劑

原料：
1. 鉬酸銨 ((NH4)6Mo7O24?4H2O) 25g
2. 硫酸鈰 (Ce(SO4)2) 5g
3. 濃硫酸 (conc. H2SO4) 50mL
4. 蒸餾水 (H2O) 450mL
調配方法： 把1,2,3,4混合后即可使用

硝酸鈰銨 (適用于：大分子醇類)

原料：

1．1%硝酸鈰銨的0.2mol/L硝酸溶液；

2. N,N-二甲基-對苯二胺鹽酸鹽1.5g溶于甲醇(128ml)、水(25ml)與乙酸(1.5ml)混合液

調配方法：將(1)與(2)等量混合。

噴板后于105℃加熱5min。

茚三酮顯色 (適用于：胺基化合物)

原料：
1. 茚三酮 ((ninhydrin) 0.3g
2. 醋酸 (AcOH) 3mL
3. 正丁醇 (n-BuOH) 100mL
調配方法：把1,2,3混合成溶液即可。

小竅門：對于比較難顯色的胺基化合物， 把TLC蘸一下HBr溶液加熱烤一下后再蘸取茚三酮顯色劑

P.S. 正丁醇有點臭, 小編用乙醇代替正丁醇用起來也沒啥問題。

二硝基苯肼顯色 簡稱：DNP顯色 (適用于：醛或酮類)

原料：
1. 2,4-二硝基苯肼 12g
2. 濃硫酸 (conc. H2SO4) 60mL
3. 蒸餾水 (H2O) 80mL
4. 乙醇 (EtOH) 200mL
調配方法： 把1,2,3,4混合成溶液即可。

堿性高錳酸鉀顯色 (廣譜顯色劑，特別是還原性化合物

原料：
1. 高錳酸鉀(KMnO4) 1.5g
2. 碳酸鉀 (K2CO3) 10g
3. 氫氧化鈉 (NaOH) 0.125g
4. 蒸餾水 (H2O) 200mL
調配方法： 把1,2,3,4混合成溶液即可。

注意要點： 試劑壽命比較短，一般三個月以內就得重新配置。

硝酸銀/過氧化氫 (適用于：鹵代烴類)

原料：

1. 硝酸銀0.1g溶于水1ml

2. 2-苯氧基乙醇l00ml溶于丙酮200mL

3. 30%過氧化氫1滴

調配方法： 把1,2,3混合成溶液即可。

方法：噴后置紫外光下照射；

現象：斑點呈暗黑色。

氯化鐵 （適用于：酚類、羥酰胺酸）

原料：1%～5%氯化鐵的0.5mol/L鹽酸溶液。

現象：酚類呈藍色、羥酰胺酸呈紅色。

溴甲酚綠顯色 簡稱：BCG顯色 (適用于：羧酸類等含有酸性基團的化合物)

原料：
1. 溴甲酚綠(Bromocresol green) 40mg
2. 乙醇 (EtOH) 100mL
3. 0.1N 氫氧化鈉水溶液 適量

調配方法：把1,2混合后，往里面滴加3直到溶液變成藍色。

過氧化氫 （適用于：芳香酸）

原料：0.3%過氧化氫溶液。

使用方法：噴后置紫外光(365nm)下觀察。

現象：呈強藍色熒光。

DRAGENDORFF試劑顯色 (適用于：含氮化合物)

原料：
1. 次硝酸鉍 (Bismuth subnitrate) 1.7g
2. 醋酸 (AcOH) 20mL
3. 蒸餾水 (H2O) 80mL
4. 碘化鉀 (KI) 40g
5. 蒸餾水 (H2O) 100mL
調配方法：A液: 1+2+3， B液：4+5， A液(5mL)+B液(5mL)+醋酸(20mL)+蒸餾水(70mL) 混合配成

香草醛顯色 (廣譜顯色劑

原料：
1. 香草醛((Vanillin) 15g
2. 濃硫酸 (conc. H2SO4) 2.5mL
3. 乙醇 (EtOH) 250mL
調配方法：把1,2,3混合后配成，使用壽命較短。

碘/硅膠顯色 (廣譜顯色劑

原料：
1. 碘(I2) 適量
2. 硅膠(SiO2) 適量
調配方法： 把1,2混合在密閉容器中靜置，顯色的時候直接只需要把TLC放進去即可，碘熏后，用水沖一下，可以增強顯色效果，并可以固定住顯色一段時間。

紫外燈-UV LAMP (適用于：共軛結構化合物)

這個就不細說了。

5%的硫酸乙醇（廣譜顯色劑，尤其是含有羥基等易于氧化的基團）

原料：

1. 98%的濃硫酸 1 g

2. 乙醇 19 g

調配方法：將濃硫酸緩慢加入到乙醇中，加入少量無水硫酸鎂干燥。

水 (適用于：最后的手段！)

在所有的顯色劑都沒用的情況下，把TLC稍微浸點水后，對著光看，有可能看到化合物的點(有機化合物不溶于水)

茜素 (適用于：硼酸/硼酸酯類化合物)

配制：1 M 的茜素丙酮溶液

顯色的時候直接只需要把TLC放進去，在366nm紫外燈下觀察有亮黃色熒光點。

注：TLC板在浸潤顯色劑后，不一定能立刻顯色的，有的需要熱烤才能顯色！

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