上海
撰文|易
細胞周期蛋白依賴性激酶是細胞周期進程的核心調控因子，其活性異常與癌癥等疾病密切相關。CDK的完全激活需要兩個關鍵步驟：一是與細胞周期蛋白結合，二是在其激活環（T-loop）上一個保守的蘇氨酸殘基（如CDK2的Thr160）被磷酸化。在動物細胞中，執行這一磷酸化任務的是CDK激活激酶，其本身也是一個由CDK7、細胞周期蛋白H和MAT1組成的激酶復合體。盡管CAK（CDK-activating kinase）在細胞生命活動中至關重要，但其識別并磷酸化其CDK底物的精確分子機制長期以來一直不清楚。此前生化研究表明，CAK對CDK的識別并不依賴于T-loop的序列，而是由遠離磷酸化位點的蛋白質相互作用所驅動，然而，這種相互作用的本質，即這種“T-loop非依賴性”識別與激活的結構基礎，仍然是一個未解之謎。填補這一關鍵知識的空白對于深入理解細胞周期調控和激酶信號傳導級聯反應具有重要意義。
近日，英國癌癥研究院結構生物學部Basil J. Greber在Science期刊上發表題為
Structural basis of T-loop
independent recognition and activation of CDKs by the CDK-activating kinase的研究論文，通過解析CAK與多種CDK底物的高分辨率結構，首次揭示了其通過一個不依賴T-loop的通用識別和激活的分子機制，解決了該領域長期存在的關鍵問題。
為了揭示CAK與CDK相互作用的結構基礎，作者采用高分辨率的冷凍電鏡技術清晰地顯示，CAK中的催化亞基CDK7與它的底物CDK2并非以之前某些計算模型預測的頭對尾方式結合，而是兩個激酶的活性中心像兩個面對面靠近的頭部，通過各自激酶結構域的N端葉和C端葉形成了兩個保守的相互作用簇，構成了一個高度對稱的對接界面。這一界面結構完美解釋了CAK何以能夠“T-loop非依賴”地識別CDK——因為作為磷酸化靶點的T-loop本身并未參與形成主要的結合接觸，而是游離在界面之外。這種對稱性也從結構基礎上闡明了CDK7與CDK2之間能夠相互磷酸化的現象，因為雙方在幾何上是等效的。
為了驗證這一結構觀察的生物學功能，作者進行了精細的位點定向突變實驗。研究發現，破壞C端葉界面簇的突變（如CDK7 L219R）幾乎完全廢除了CAK的激酶活性，而針對N端葉界面簇的突變（如CDK7 H47A/R48A）也顯著降低了活性。這強有力地證明，這兩個新發現的相互作用簇對于CDK的激活是缺一不可的，任何一處的破壞都足以瓦解整個激酶-激酶復合物的功能穩定性。特別有趣的是，研究還解決了一個關于CDK激活順序的爭議：結構顯示，CAK與另一種CDK結合蛋白Cks1在CDK2的C端葉結合位點上存在空間競爭。隨后的功能實驗證實，Cks1的存在確實會劑量依賴性地抑制CAK對CDK2的磷酸化，這確立了細胞周期中一個關鍵的調控順序——CDK必須先被CAK激活（磷酸化），之后才能招募Cks1來執行其下游功能。
為了證明這一相互作用界面的普遍性，而不僅僅是CDK2的特例，作者團隊做了兩方面驗證。在計算層面，作者利用AlphaFold3成功預測了CAK與多種已知底物CDK的復合物結構，其界面與實驗觀察到的CDK7-CDK2界面高度相似；而對于非底物CDK，AlphaFold3則無法給出高置信度的預測。在實驗層面，作者進一步解析了CAK與另外兩個重要生理底物——CDK1-細胞周期蛋白B1和相對進化關系較遠的CDK11的冷凍電鏡結構。結果表明，盡管這些CDK在細胞功能和解聚通路上存在差異，但它們與CAK的結合模式與CDK2幾乎完全相同，從而確立了這是一種CAK激活其CDK底物的“通用結構密碼”。
此外，研究還揭示了調控磷酸化效率的一個精妙的結構動力學機制。通過比較CAK與單體CDK2以及CAK與CDK2-細胞周期蛋白A2的復合物結構，作者發現，當CDK2與細胞周期蛋白A2結合后，其T-loop會與細胞周期蛋白發生相互作用，從而被鎖定在一個伸展的、遠離CDK7活性中心的構象中，這使得磷酸化靶點Thr160難以進入催化位點。相反，單體CDK2的T-loop則表現出高度的構象靈活性，可以更自由地擺動，從而增加了其成功進入CDK7活性中心并被磷酸化的概率。這從結構動力學角度完美解釋了先前觀察到的生化現象——CAK對單體CDK2的催化周轉率反而高于對其與細胞周期蛋白結合的、更穩定的形式。
綜上所述，本研究解析了CAK與CDK2及CDK2-細胞周期蛋白A2復合物的高分辨率結構，揭示了一個不依賴于T-loop的激酶-激酶界面，該界面由激酶的兩個結構瓣共同參與形成。計算分析以及CAK與CDK1-細胞周期蛋白B1和CDK11復合物的結構表明，這些結構代表了CAK-CDK復合物的通用架構。這些結果增進了大家對細胞周期調控和激酶信號級聯反應的機制性理解，為后續針對該通路的精準藥物干預奠定了堅實的結構基礎。
https://www.science.org/doi/10.1126/science.adw0053
制版人： 十一
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