非CG甲基化可促進轉錄因子結合，福建農林大學朱方捷/上交九院黃晶合作解析WRKY順式元件組

DNA甲基化是最早被鑒定的表觀修飾。動物基因組中DNA甲基化通常發生于CG二核苷酸，然而，植物中除CG甲基化外，還存在大量非CG甲基化（CHG和CHH，H=A/G/T）。非CG甲基化對植物轉座子沉默至關重要，同時也常見于啟動子區（如CHH island）。前期研究認為，非CG甲基化抑制轉錄因子（TF）結合【1，2】。然而，該結論假設DNA甲基化不改變TF序列特異性（即不改變TF基序），假設未必成立。

近日，福建農林大學海峽聯合研究院朱方捷教授團隊聯合上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院上海精準醫學研究院黃晶研究員團隊在Nucleic Acids Research在線發表了題為The specificity landscape of WRKY transcription factors reveals the bidirectional influence of non-CG methylation。的研究論文。該研究開發了高通量全甲基化系統進化技術methyl-SELEX與methyl-ampDAP-seq，并利用其構建了54個WRKY家族TFs的461個順式元件組文庫。數據分析表明，非CG甲基化可顯著改變WRKY序列特異性，且甲基化對WRKY親和力的調控具明顯雙向性——取決于結合模式、位置、以及具體WRKY因子，非CG甲基化既可抑制、也可促進TF結合。同時，本工作提供了目前最完整的WRKY家族順式元件組數據集，構建了WRKY數據庫WRCD（https://transysbio.cn/WRKYRCDB.php）。

該研究以擬南芥WRKY家族TFs為研究對象，利用SELEX、DAP-seq、ampDAP-seq以及建立的高通量methyl-SELEX、methyl-ampDAP-seq，系統研究了54個WRKY轉錄因子在非甲基化、體內天然甲基化、全甲基化背景下的序列特異性及全基因組順式元件位點。共整理出201個WRKY單體基序（圖1上）。該研究既鑒定到WRKY家族傳統的順式元件，如W-box與WT-box，也鑒定到了大量新型WRKY順式元件。所有單體基序可聚為11類（圖1下），其中5類為首次報道的WRKY家族序列特異性（圖1下，粗體注釋的class）。11類單體基序中，類別1-5為非甲基化時WRKY的識別基序，類別6-11為甲基化時WRKY的識別基序，表明甲基化可顯著改變WRKY的序列特異性。此外，對于已報導的WRKY順式元件PRE4，分析表明其僅在甲基化條件下可被WRKY識別。

圖1：各WRKY識別的單體基序

該研究進一步分析了有/無甲基化條件下WRKY二聚體的序列特異性，結果表明，甲基化不僅改變WRKY單體結合的序列特異性，也改變WRKY同源二聚體的序列特異性。

隨后，本工作系統解析了DNA甲基化對WRKY親和力的影響（圖2），證明了甲基化的影響具有明顯雙向性。（1）對于不同WRKY結合模式，其親和力對甲基化的響應不同（圖2A）：盡管WRKY識別的非甲基化、甲基化基序中均含有C（或G），但對于非甲基化時WRKY識別的基序，相關序列甲基化時親和力減弱；對于甲基化時WRKY識別的基序，相關序列甲基化時親和力增強。（2）對于WRKY基序中不同位置的C，甲基化的影響也不同（圖2C、E）。例如對所有WRKY，C4位的DNA甲基化均減弱其親和力，但C7位的甲基化對親和力的影響則具多樣性——增加WRKY29/35等的親和力，但減弱WRKY46/65等的親和力。（3）此外，DNA甲基化不但雙向影響5mC自身與WRKY的親和力，也同時雙向影響附近A/T堿基的親和力（圖2F-H）。

進一步比較ampDAP-seq與methyl-ampDAP-seq文庫表明，甲基化時，WRKY結合的全基因組順式元件也發生明顯的變化。然而，甲基化條件下，WRKY識別的順式元件仍靶向WRKY的經典功能（SA通路、免疫反應等），因此推測植物基因組中的甲基化順式元件也參與構建了WRKY下游的轉錄調控網絡，對WRKY行使正常生理功能具有重要意義。

圖2：甲基化既可促進，也可抑制WRKY結合

最后，為促進數據共享，本研究整合新產生數據與先前已發表的WRKY順式元件組數據，構建了WRCD數據庫（圖3，https://transysbio.cn/WRKYRCDB.php）。

圖3：WRKY順式元件組數據庫

綜上，該研究繪制了WRKY順式元件組圖譜，揭示了非CG甲基化可雙向影響WRKY親和力，并可重塑WRKY的下游轉錄調控網絡。所揭示的雙向性影響為合成生物學中順式元件的設計提供了重要參考：例如植物轉基因時，外來基因常被DNA甲基化沉默，根據本研究數據，有望設計出甲基化條件下仍能結合TF并促進轉錄的順式元件。

福建農林大學生命科學學院已畢業博士研究生馬娜娜、已畢業碩士研究生蔣定坤、未來技術學院博士研究生李甜、浙江大學博士后羅琳為該論文共同第一作者。福建農林大學海峽聯合研究院朱方捷教授、生命科學學院郭洪洪講師、上海精準醫學研究院黃晶研究員為該論文的共同通訊作者。該研究得到國家自然科學基金、國家重點研發計劃、福建省“雛鷹計劃”、福建省重大專項以及福建農林大學的資助。

參考文獻：

1. Charvin, M. et al. Single-cytosine methylation at W-boxes repels binding of WRKY transcription factors through steric hindrance. Plant Physiol.192, 77–84 (2023).

2. O’Malley, R. C. et al. Cistrome and epicistrome features shape the regulatory DNA landscape. Cell165, 1280–1292 (2016).

https://academic.oup.com/nar/article/53/21/gkaf1168/8328560?searchresult=1