打破認(rèn)知差：培養(yǎng)基干凈 ≠ 內(nèi)毒素安全，0.02 ng/mL 就能激活免疫反應(yīng)

內(nèi)毒素是一種由細(xì)菌細(xì)胞壁分解產(chǎn)生的毒性物質(zhì),其主要成分為脂多糖（LPS），是細(xì)胞培養(yǎng)過程中不容忽視的問題。細(xì)胞培養(yǎng)試劑或介質(zhì)內(nèi)毒素過高，會(huì)干擾細(xì)胞的正常生長和分化，甚至導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。內(nèi)毒素通過誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)抑制細(xì)胞生長或誘導(dǎo)其凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，低濃度內(nèi)毒素（< 1 ng/mL，1 ng ≈ 10 EU）可刺激細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子、激活小鼠巨噬細(xì)胞。

內(nèi)毒素如何偷偷毀掉細(xì)胞實(shí)驗(yàn)？

細(xì)胞莫名其妙死亡、轉(zhuǎn)染效率低至 30%、同樣的 protocol 卻做不出重復(fù)結(jié)果——遇到這些問題，你的第一反應(yīng)是什么？細(xì)胞狀態(tài)不好？血清批次有問題？轉(zhuǎn)染試劑不給力？

很少有人會(huì)想到這可能是內(nèi)毒素在「搗亂」。它隱藏在細(xì)胞培養(yǎng)基、添加物、質(zhì)粒中，難以被發(fā)現(xiàn)，卻悄無聲息地吞噬著實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和結(jié)果。內(nèi)毒素可能從一開始就在那里，只是你從來沒測過。

你以為培養(yǎng)基澄清透明就是干凈的？你以為「內(nèi)毒素達(dá)標(biāo)」就安全了？藥典標(biāo)準(zhǔn)是 0.5 EU/mL，但你的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)需要的，可能是比藥典嚴(yán)苛 10 倍的條件。內(nèi)毒素是細(xì)胞培養(yǎng)中最容易被忽視的「潛伏者」。它藏在血清里、藏在重組蛋白里、藏在質(zhì)粒里，悄無聲息地篡改你的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。這一次，我們來聊聊這個(gè)你「以為知道」、但可能低估了的隱形殺手。

一、0.02 ng/mL 的內(nèi)毒素就能對細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生影響

多種細(xì)胞易受內(nèi)毒素影響，如巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、肝細(xì)胞、血小板、內(nèi)皮細(xì)胞等。極低濃度的內(nèi)毒素就能干擾細(xì)胞正常的生理功能。Schwarz H 等人發(fā)現(xiàn) 0.02～2 ng/m L的脂多糖（LPS）能激活細(xì)胞的免疫反應(yīng)，且不同細(xì)胞對內(nèi)毒素的敏感度不一樣。如 THP-1 細(xì)胞在受到最高濃度 LPS（2 ng/mL）刺激時(shí)，僅 IL-8 表達(dá)量顯著增加，而在相同濃度下，moDCs 會(huì)大量分泌 IL-6、IL-8、IL-12 和 TNF-α。人單核細(xì)胞和 CD1c+ DCs 對內(nèi)毒素更敏感，0.2 ng/mL 的 LPS 能夠誘導(dǎo)所有細(xì)胞因子釋放。

0.02 ng/mL 是什么概念？相當(dāng)于在標(biāo)準(zhǔn)游泳池里滴入一滴水，濃度低到可以忽略不計(jì)。但對于 THP-1 細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、原代免疫細(xì)胞來說，這個(gè)濃度的內(nèi)毒素足以讓它們「炸鍋」，細(xì)胞還沒開始正式實(shí)驗(yàn)，就已經(jīng)被「提前激活」了。

低濃度 LPS 對不同人類免疫細(xì)胞細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響（源自文獻(xiàn)：DOI:10.1371/journal.pone.0113840）

內(nèi)毒素能夠與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合，激活免疫反應(yīng)，釋放 TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8 等炎性細(xì)胞因子，影響細(xì)胞生理功能和信號(hào)通路紊亂，進(jìn)而影響細(xì)胞生長和代謝，甚至造成細(xì)胞凋亡。內(nèi)毒素提前激活免疫細(xì)胞會(huì)干擾對細(xì)胞因子正常免疫調(diào)節(jié)功能的研究，出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差。

內(nèi)毒素過高會(huì)造成細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，如體積縮小、折光率降低等。內(nèi)毒素還抑制細(xì)胞的增殖，如 G0/G1 期延長、S 期縮短等會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞生長停滯或凋亡。內(nèi)毒素在敏感細(xì)胞中誘導(dǎo) caspase-3 介導(dǎo)的凋亡通路，使原代細(xì)胞存活率驟降。內(nèi)毒素通過磷酸基團(tuán)與細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，或脂肪酸鏈與細(xì)胞膜上的脂質(zhì)膜和蛋白質(zhì)親水區(qū)發(fā)生作用，改變細(xì)胞膜形態(tài)，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙。

研究人員通過 MTT 法測定了脂多糖（LPS）對 H292 和 THP-1 細(xì)胞的毒性作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未處理的對照組相比，低濃度（1～2.5 μg/mL） LPS 處理后，細(xì)胞活力未觀察到顯著變化，表明此濃度下的 LPS 對細(xì)胞無毒性。而高濃度（5～20 μg/mL）的 LPS 對 H292 和 THP-1 細(xì)胞具有顯著的細(xì)胞毒性。

LPS 刺激對 H292 與 THP-1 細(xì)胞活力的影響（源自文獻(xiàn)：DOI：10.3892/mmr.2018.8542）

內(nèi)毒素對細(xì)胞功能有顯著影響，如影響細(xì)胞的基因表達(dá)、能量代謝和蛋白質(zhì)合成。內(nèi)毒素還會(huì)與轉(zhuǎn)染試劑、質(zhì)粒 DNA 降低細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。

因此，在細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，內(nèi)毒素影響細(xì)胞的生理狀態(tài)和功能，降低實(shí)驗(yàn)的可靠性和可重復(fù)性，此外，內(nèi)毒素的存在可能影響細(xì)胞因子和蛋白質(zhì)的表達(dá)控制，細(xì)胞信號(hào)通路、蛋白質(zhì)相互作用等研究需要注意內(nèi)毒素的干擾。對于細(xì)胞衍生產(chǎn)品（如疫苗、免疫細(xì)胞治療等）更應(yīng)關(guān)注內(nèi)毒素污染。

二. 細(xì)胞培養(yǎng)過程中如何避免內(nèi)毒素污染

革蘭氏陰性菌是細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中的常見污染源，細(xì)菌死亡裂解或?qū)е聝?nèi)毒素釋放。培養(yǎng)基中的血清或蛋白質(zhì)成分含有較高內(nèi)毒素也會(huì)影響細(xì)胞生長。在細(xì)胞的傳代、凍存等環(huán)節(jié)操作不當(dāng)也會(huì)導(dǎo)致內(nèi)毒素污染。細(xì)胞培養(yǎng)所有容器和包裝材料也會(huì)因制造工藝而含有內(nèi)毒素。

針對內(nèi)毒素污染的來源，可以通過以下措施控制內(nèi)毒素：

原料控制：選擇低內(nèi)毒素或超低內(nèi)毒素的試劑和介質(zhì)，從源頭控制內(nèi)毒素。

細(xì)胞株選擇：某些腫瘤細(xì)胞株對內(nèi)毒素敏感度較低可優(yōu)先選擇。

培養(yǎng)環(huán)境選擇：定期殺菌和在位清洗，減少大腸桿菌污染。優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)條件，如溫度、pH 值、滲透壓等，以降低內(nèi)毒素對細(xì)胞的不良影響。

質(zhì)量控制：對所用試劑進(jìn)行內(nèi)毒素檢測，保證內(nèi)毒素含量符合標(biāo)準(zhǔn)。

人員培訓(xùn)：確保操作合規(guī)，避免人員操作問題引入細(xì)菌內(nèi)毒素。

三、重組蛋白內(nèi)毒素對細(xì)胞培養(yǎng)的影響

重組細(xì)胞因子在細(xì)胞培養(yǎng)和擴(kuò)增分化過程中具有重要作用。免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)、干細(xì)胞培養(yǎng)與分化、類器官模型構(gòu)建等，都需要使用低水平內(nèi)毒素的細(xì)胞因子。細(xì)胞因子功能分析、蛋白互作研究，使用更低水平內(nèi)毒素的重組蛋白是獲取可靠實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)。

為評(píng)估重組蛋白中內(nèi)毒素對細(xì)胞的免疫反應(yīng)，Schwarz H 等人構(gòu)建了對 LPS 高度敏感的 HEK293 細(xì)胞，將這些細(xì)胞分別暴露于不同濃度的重組蛋白（來自兩個(gè)不同的供應(yīng)商）和 LPS 中。結(jié)果顯示，供應(yīng)商 1 的重組蛋白可使 NF-kB 表達(dá)量升高，而供應(yīng)商 2 的重組蛋白則未激活 NF-kB 表達(dá)。供應(yīng)商 1 重組蛋白誘導(dǎo) NF-kB 表達(dá)的效果與 0.02 ng/mL LPS 相近，說明重組蛋白中少量內(nèi)毒素污染（1.4 EU，0.014 ng/100 ng 蛋白）足以激活 NF-κB 通路。

內(nèi)毒素對 HEK293 細(xì)胞中 NF-kB 激活的影響（源自文獻(xiàn)：DOI:10.1371/journal.pone.0113840）

內(nèi)毒素污染自查清單

你中了幾條？

以下場景，如果你中了 3 條以上，你的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可能正在被內(nèi)毒素「偷走」。

試劑耗材篇

用的重組蛋白、細(xì)胞因子，從來沒測過內(nèi)毒素水平

只知道內(nèi)毒素「達(dá)標(biāo)」（< 0.5 EU/mL），不知道自己的細(xì)胞需要多低的閾值

血清分裝后反復(fù)凍融，瓶口有肉眼可見的殘留

用的超純水，超過一周沒換機(jī)、沒測電阻率

日常操作篇

培養(yǎng)基配制后，存放超過兩周還在用

槍頭、離心管是「國產(chǎn)某品牌」，但沒驗(yàn)證過無熱原

開瓶后的試劑，瓶蓋朝下放在臺(tái)面上

細(xì)胞房里的酒精棉球，泡了三天沒換

培養(yǎng)環(huán)境篇

培養(yǎng)箱水盤里的水，一個(gè)月沒換過

細(xì)胞房最近有過細(xì)菌污染，簡單消殺后繼續(xù)用

同一瓶培養(yǎng)基，同時(shí)養(yǎng)免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞

做原代細(xì)胞培養(yǎng)，沒單獨(dú)配一瓶「專用培養(yǎng)基」

細(xì)胞狀態(tài)篇

細(xì)胞長得慢，第一反應(yīng)是「血清不行」，而不是測一下內(nèi)毒素

轉(zhuǎn)染效率突然下降，懷疑是質(zhì)粒問題，沒想過是內(nèi)毒素干擾

同樣 protocol，兩個(gè)人做出來結(jié)果不一樣，以為是操作問題

細(xì)胞形態(tài)沒變、培養(yǎng)基也沒渾，就默認(rèn)「沒問題」

如果你中了 3 條以上，建議下次實(shí)驗(yàn)前，先測一下你的培養(yǎng)基、血清、重組蛋白——內(nèi)毒素這個(gè)「隱形殺手」，可能比你想象的離你更近。自查清單里那些「坑」，有些靠規(guī)范操作就能填上——比如勤換水、不反復(fù)凍融、分區(qū)使用培養(yǎng)基。但有些問題，不是操作能解決的：你用的重組蛋白本身自帶內(nèi)毒素，換再多槍頭、擦再多遍臺(tái)面也沒用。這時(shí)候就需要從源頭入手——選擇真正「超低內(nèi)毒素」的試劑，而不是只看標(biāo)簽上寫著「達(dá)標(biāo)」。

義翹神州 ProPure?

超低內(nèi)毒素蛋白及定制服務(wù)

義翹神州位于德克薩斯州的生物工程中心（C4B）采用先進(jìn)的技術(shù)和設(shè)備生產(chǎn) ProPure? 超低內(nèi)毒素蛋白，內(nèi)毒素水平低于定量限（BQL）（< 0.05 EU/mg），顯著優(yōu)于行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（USP <85>：0.5 EU/mg），適用于臨床前動(dòng)物研究、嚴(yán)格的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)與高敏檢測分析。同時(shí)，C4B 還提供超低內(nèi)毒素蛋白定制服務(wù)，滿足臨床前和藥物開發(fā)中對內(nèi)毒素控制的更高標(biāo)準(zhǔn)需求。

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內(nèi)容策劃：王丹琦

內(nèi)容審核：周育紅

題圖來源：圖蟲創(chuàng)意

參考文獻(xiàn)：

[1] Schwarz H, et al. Residual Endotoxin Contaminations in Recombinant Proteins Are Sufficient to Activate Human CD1c+ Dendritic Cells. PLoS ONE. 2014. doi:10.1371/journal.pone.0113840

[2] Xuefang Liu, et al. LPS?induced proinflammatory cytokine expression in human airway epithelial cells and macrophages via NF-κB, STAT3 or AP-1 activation. Mol Med Rep. 2018. doi: 10.3892/mmr.2018.8542