Adv?Sci丨建立“雙小分子協同 + 化學成分明確” 的 ANSCs 誘導體系

神經干細胞（NSCs）作為中樞神經系統（CNS）的 “種子細胞”，具備自我更新與多向分化潛能（可分化為神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞），在神經退行性疾病（如阿爾茨海默病）、神經損傷及神經精神疾病（如抑郁癥）的細胞治療中具有不可替代的價值。人多能干細胞（hPSC，包括胚胎干細胞 ESC 和誘導多能干細胞 iPSC）可分化為 NSCs，為臨床應用提供了無限的細胞來源。然而，當前 hPSC 向 NSCs 誘導的臨床轉化仍面臨三大核心瓶頸：① 傳統方案依賴病毒載體、復雜轉錄因子或 undefined 培養基，存在成瘤風險、操作繁瑣且重復性差；② 誘導的 NSCs 神經譜系定向分化潛能不足，均一性低，難以滿足臨床治療的功能需求；③ 分化機制尚未完全闡明，尤其是表觀遺傳調控與代謝重編程在神經命運決定中的協同作用仍不明確，制約了誘導體系的優化。

為解決這些問題，研究人員嘗試通過小分子化合物調控細胞信號通路以優化誘導效率。視黃酸（RA）信號與 Wnt 信號在胚胎神經發育中扮演關鍵角色，前者通過激活視黃酸受體（RAR）促進神經分化，后者則調控神經前體細胞的增殖與命運決定。TTNPB 作為強效 RAR 激動劑，已被證實參與細胞重編程與分化調控，而 CHIR99021 作為經典 Wnt 信號激活劑，可誘導 hPSC 向 NSCs 分化。但二者協同誘導 hPSC 向 NSCs 分化的效果、核心機制，以及誘導細胞的體內功能驗證，此前尚未有系統報道。

近日，內蒙古大學陳楊林、包斯琴、吳智敏、李喜和團隊在國際期刊Advanced Science在線發表了一項突破性研究，題為TTNPB Promotes Human Pluripotent Stem Cell-to-Neural Stem Cell Transition via Modulation of Chromatin Accessibility and the S-(5'-adenosyl)-L-homocysteine/Choline Metabolic Network。該研究建立 “TTNPB+CHIR99021” 雙小分子協同誘導體系，在化學成分明確的 N2B27 培養基中，從hPSC高效分化出進階神經干細胞（ANSCs），并通過轉錄組、ATAC-seq、代謝組學及體內功能實驗，系統揭示了 “表觀遺傳重塑 - 代謝重編程” 協同驅動神經分化的核心機制，且證實 ANSCs 在抑郁模型大鼠中具有顯著治療效果，為神經疾病細胞治療提供了全新策略。

研究團隊首先優化誘導體系：在 N2B27 化學成分明確培養基中，以 3μM CHIR99021（已驗證有效濃度）聯合不同濃度 TTNPB 處理 hPSC，發現 0.5μM TTNPB 即可顯著上調神經外胚層基因（SOX2、PAX6、SOX1）表達，由此確定 “0.5μM TTNPB+3μM CHIR99021+N2B27” 為最優誘導體系，誘導的細胞命名為 ANSCs。進一步驗證顯示，ANSCs 具有長期自我更新能力，傳代超過 50 代仍保持穩定核型與堿性磷酸酶（AP）陽性，顯著優于傳統 NSCs；免疫熒光與 RNA-seq 證實，ANSCs 低表達多能基因（OCT4、NANOG），高表達神經外胚層關鍵基因（PAX6、SOX1、NES、NEUROG2），自發分化 9 天后，神經元標志物 TUBB3、膠質細胞標志物 SOX10 表達量顯著高于傳統 NSCs，且該體系在 H9 ESC、Z1 iPSC 等不同細胞系中均能穩定誘導 ANSCs，證實了體系的普適性。值得注意的是，單獨使用 TTNPB 雖能產生一定作用，但無法維持細胞存活與增殖，而 CHIR99021 的存在是 ANSCs 存活的必要條件 —— 去除 CHIR99021 后，僅 TTNPB 處理會導致細胞大量死亡，證實二者的協同作用不僅體現在誘導效率，更體現在細胞穩態維持上。

為探究協同誘導的表觀遺傳機制，團隊對 hPSC、傳統 NSCs 和 ANSCs 進行 ATAC-seq 分析，結果顯示 ANSCs 的全局染色質可及性顯著高于 hPSC 和傳統 NSCs，尤其是在轉錄起始位點（TSS）±3kb 區域，表現出更強的信號富集。具體而言，神經外胚層特異性基因（PAX6、SOX1、NEUROG2）的染色質可及性顯著增強，而多能性基因（POU5F1、ZFP42）的可及性顯著降低，為神經分化基因的轉錄激活提供了表觀遺傳基礎；轉錄因子活性分析顯示，ANSCs 中 PAX3/7、HOXB9 等神經譜系轉錄因子活性升高，AP-1 復合體（JUNB、FOSL1）被激活，而 KLF 家族等多能性轉錄因子活性受抑制，形成特異性轉錄調控網絡；與傳統 NSCs 相比，ANSCs 有 3758 個染色質可及性峰上調，僅 363 個下調，且差異峰主要位于基因間區，提示 TTNPB 可能通過調控遠端調控元件增強 CHIR99021 的神經誘導效應。

非靶向代謝組學分析揭示了 ANSCs 的特異性代謝特征：與 hPSC 和傳統 NSCs 相比，ANSCs 中 S - 腺苷同型半胱氨酸（SAH）、二磷酸腺苷（ADP）、谷胱甘肽（GSH）、L - 脯氨酸水平顯著升高，且這些代謝物與神經外胚層基因表達呈強正相關。進一步功能驗證發現，外源性補充 SAH 可顯著上調 NSCs 和 hPSC 中神經標志物 NESTIN 的表達（NSCs 中提升 15 倍以上），并誘導 hPSC 形成神經球樣結構；膽堿作為磷脂酰膽堿（PC）的代謝產物，補充后可劑量依賴性促進神經分化，50μM 時效果最佳，且與神經基因（NEUROG1、PAX6）表達正相關；機制上，TTNPB 通過激活 RA 信號，直接上調磷脂酰乙醇胺 N - 甲基轉移酶（PEMT）的表達（其啟動子區域染色質可及性增強），促進磷脂酰乙醇胺（PE）向 PC 轉化，進而生成膽堿；同時，SAH 水解產生的同型半胱氨酸可促進 GSH 合成，形成 “TTNPB-PEMT-SAH / 膽堿” 核心代謝網絡，為神經分化提供膜結構原料與氧化還原平衡支持。

為驗證 ANSCs 的臨床應用潛力，團隊構建了慢性不可預測溫和應激（CUMS）+ 脂多糖（LPS）誘導的抑郁模型大鼠，將 tdTomato 標記的 ANSCs 或傳統 NSCs 通過立體定向注射到大鼠海馬區。結果顯示，移植后 7 天，ANSCs 在大鼠海馬區成功定植并存活，且存活數量顯著多于傳統 NSCs；行為學檢測證實，ANSCs 移植組大鼠體重下降幅度減小，蔗糖偏好率顯著提升，曠場試驗總移動距離、高架十字迷宮開臂停留時間均恢復至接近正常水平，抑郁樣行為得到顯著改善；分子機制上，移植后大鼠海馬區炎癥水平降低（脾指數下降），轉錄組特征向正常對照組靠攏，證實 ANSCs 可通過調節海馬微環境、分泌神經營養因子等方式發揮治療作用。

該研究首次建立了 “雙小分子協同 + 化學成分明確” 的 ANSCs 誘導體系，系統闡明了 TTNPB 與 CHIR99021 通過 “表觀遺傳重塑 - 代謝重編程” 協同驅動 hPSC 向神經干細胞分化的核心機制：TTNPB 作為 “表觀遺傳調節劑”，增強神經分化基因的染色質可及性，放大 CHIR99021 的神經誘導效應；同時，二者協同激活 SAH / 膽堿代謝網絡，為神經命運決定提供內在能量與物質支持。誘導的 ANSCs 不僅具備 “高效分化、長期增殖、安全無毒” 的技術優勢，更在抑郁模型中展現出顯著治療效果，為神經疾病的細胞治療提供了全新的種子細胞來源。此外，該研究還為細胞命運轉換的機制研究提供了新范式 —— 首次揭示 RA 信號在神經分化中的 “表觀遺傳 - 代謝” 雙重調控作用，為后續小分子誘導體系的優化提供了理論依據。未來，隨著該體系的進一步完善，有望在阿爾茨海默病、脊髓損傷等更多神經疾病模型中開展驗證，加速干細胞療法的臨床轉化進程。

原文鏈接：https://doi.org/10.1002/advs.202515648

制版人：十一

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