北京化工大學徐福建教授團隊《自然·通訊》：仿生納米平臺以“能量中斷”策略逆轉銅綠假單胞菌耐藥性

抗菌素耐藥性（AMR）的快速出現已成為當今最緊迫的全球公共衛生挑戰之一，這使得傳統抗生素對多種病原菌逐漸失效。尤其令人擔憂的是革蘭氏陰性菌，如銅綠假單胞菌，這種高優先級病原體因其固有的耐藥機制（如低外膜滲透性和高表達外排泵）而臭名昭著，是免疫功能低下患者（如囊性纖維化患者）呼吸道感染的主要致病菌。根據2022年CHINET報告，它在臨床呼吸道病原體中名列前茅。盡管β-內酰胺類、氨基糖苷類和氟喹諾酮類藥物是當前治療銅綠假單胞菌感染的主要手段，但耐藥性的發展嚴重損害了其療效。更嚴峻的是，自1980年代以來，針對革蘭氏陰性菌的新型抗生素開發進展甚微，這使得優化現有抗生素療效的策略變得迫在眉睫。

針對上述挑戰，北京化工大學徐福建教授、趙娜娜教授與張凱副教授團隊提出并展示了一種仿生納米平臺（Ce-Car@EV NPs）。該平臺通過合理整合姜來源的細胞外囊泡（EVs）和pH響應性的鈰-羧芐青霉素配位納米顆粒（Ce-Car NCPs）構建而成。這種設計實現了納米顆粒在體內的長效循環，并能在酸性的感染部位特異性降解，從而釋放出Ce??離子和羧芐青霉素。釋放的Ce??離子能穿透細菌細胞，通過破壞ATP合成、阻礙氧化磷酸化并抑制外排泵活性來干擾細菌的能量代謝。通過耗竭ATP并阻斷外排泵，Ce??離子作為羧芐青霉素的強效佐劑，成功地逆轉了細菌耐藥性。研究團隊在體內外證實，該策略能有效恢復羧芐青霉素對耐藥銅綠假單胞菌的殺菌效力，為利用金屬佐劑對抗抗菌素耐藥性建立了一種新的治療范式。相關論文以“Biomimetic metal-drug coordination nanoplatform to counteract drug resistance in Pseudomonas aeruginosa via energy disruption”為題，發表在

Nature Communications

研究團隊首先通過一鍋法自組裝成功制備了Ce-Car NCPs，隨后通過超聲處理將其封裝在姜來源的EVs中，形成Ce-Car@EV NPs。透射電鏡圖像清晰顯示，約10 nm的Ce-Car NCPs被成功包裹在典型的碟形EVs內部，XPS、FTIR及分子軌道模擬等多種表征手段證實了Ce(IV)與羧芐青霉素之間的成功配位以及EVs的成功包覆。更重要的是，體外釋放研究表明，在模擬感染微環境的酸性條件（pH 5.5）下，該納米平臺在12小時內釋放了超過70%的羧芐青霉素，而在生理條件（pH 7.4）下釋放量不足15%，展現出了優異的pH響應控制釋放能力。進一步的分子對接模擬顯示，Ce(IV)的存在不僅能通過靜電吸引增強羧芐青霉素與其靶標蛋白PBP3的結合力（結合能從-6.93 kcal/mol降至-7.84 kcal/mol），還能穩定藥物-蛋白復合物，從而協同增強抗菌效果。

圖1. 仿生Ce-Car@EVs納米平臺示意圖：用于在小鼠肺炎模型中對抗耐藥銅綠假單胞菌感染，該平臺具有高細胞內抗生素滯留和體內長循環的特性。

圖2. Ce-Car@EV NPs的制備與表征。 a Ce-Car@EV NPs的制備流程示意圖。 b Ce-Car NCPs、G-EVs和Ce-Car@EV NPs的透射電鏡圖像。 c Ce-Car NCPs的最高占據分子軌道（HOMO）和最低未占分子軌道（LUMO）的局部電荷密度圖。 d Car和Ce-Car NCPs的傅里葉變換紅外光譜。 e Ce-Car NCPs、G-EVs和Ce-Car@EV NPs的Zeta電位。 f Ce-Car@EV NPs在pH 5.5和7.4的Tris-HCl緩沖液中的Car釋放曲線。 g G-EVs和Ce-Car@EV NPs的SDS-PAGE蛋白分析。 h 在無Ce(IV)情況下，Car與青霉素結合蛋白3（PBP3）結合的分子對接模擬。 i 在有Ce(IV)情況下，Car與PBP3結合的分子對接模擬。

體外抗菌實驗證實了這種pH響應性帶來的優勢。在pH 5.5的酸性環境下，32 μg/mL的Ce-Car@EV NPs能殺滅96.81%的銅綠假單胞菌，而在pH 7.4時細菌存活率仍高于80%。活/死細菌染色和掃描電鏡圖像也直觀地顯示，只有在酸性條件下經Ce-Car@EV NPs處理的細菌才出現大量死亡和嚴重的結構變形。棋盤稀釋法驗證了Ce(IV)與羧芐青霉素的協同作用（FICI指數為0.5）。更為關鍵的是，在連續傳代30次的耐藥性誘導實驗中，游離羧芐青霉素處理組的最低抑菌濃度（MIC）飆升了256倍，而Ce-Car@EV NPs處理組則顯著延遲且降低了耐藥性的產生。對于已產生的耐藥菌，Ce-Car@EV NPs在16 μg/mL的濃度下就能將其殺滅，而游離羧芐青霉素在高達2048 μg/mL時仍效果不佳。

圖3. Ce-Car@EV NPs的體外抗菌性能。 a 在pH 5.5和7.4條件下，不同濃度Ce-Car@EV NPs處理2小時后標準銅綠假單胞菌的活力。 b 不同pH條件下，經Ce-Car@EV NPs處理后的銅綠假單胞菌活/死染色。 c 不同pH條件下，經Ce-Car@EV NPs處理后銅綠假單胞菌的掃描電鏡圖像。 d Car和Ce(IV)聯合抗銅綠假單胞菌的棋盤稀釋法協同效應分析。 e 經Ce-Car@EV NPs誘導30代后，銅綠假單胞菌對Car的耐藥性發展。 f Car和Ce(IV)聯合抗耐藥銅綠假單胞菌的棋盤稀釋法協同效應分析。 g Car和Ce-Car@EV NPs對耐藥銅綠假單胞菌的抗菌效果。 h 不同濃度Car和Ce-Car@EV NPs與耐藥銅綠假單胞菌共孵育4小時后的細菌活力。 i 對應h圖的耐藥銅綠假單胞菌平板計數數據。

為了深入揭示其克服耐藥性的機制，研究團隊進行了轉錄組學分析。結果表明，與游離羧芐青霉素誘導的耐藥菌相比，經Ce-Car@EV NPs處理的細菌其基因表達譜變化幅度更小。京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析顯示，差異基因顯著富集在碳代謝、氧化磷酸化、糖酵解/TCA循環等能量代謝通路上。熱圖分析進一步揭示，Ce-Car@EV NPs能顯著下調耐藥菌中高表達的外排泵基因（如mexA、mexB、oprM），并將其表達水平恢復至正常。同時，氧化磷酸化復合物I和IV的基因（如nuoE、ccoN2）以及TCA循環和糖酵解的關鍵酶基因（如acnA、pykA）也顯著下調。功能實驗驗證了這些轉錄水平的變化：Ce-Car@EV NPs以濃度依賴的方式顯著降低細菌內ATP含量（100 μg/mL時降低60%），并抑制呼吸鏈復合物I和IV的活性，從而阻斷了外排泵的能量供應，使其外排功能顯著下降。這一系列多層次、多靶點的調控，構成了其逆轉耐藥性的強大分子基礎。

圖4. Ce-Car@EV NPs克服銅綠假單胞菌耐藥性的機制。 a 三組細菌差異表達基因（DEGs）的韋恩圖。 b 不同處理后細菌DEGs的火山圖。 c PA-30M和PA-30R細胞間DEGs的基因本體論（GO）注釋分析。 d PA-30M和PA-30R細胞間DEGs的KEGG富集分析。 e 基于表達模式的細菌多藥外排相關基因的聚類分析。 f PA、PA-30R和PA-30M細胞中氧化磷酸化相關基因的熱圖。 g PA、PA-30R和PA-30M細胞中TCA循環和糖酵解相關基因的熱圖。 h Ce-Car@EV NPs作用于氧化磷酸化過程的機制示意圖。 i 不同濃度Ce-Car@EV NPs直接孵育后的ATP含量。 j 經不同濃度Ce-Car@EV NPs處理24小時后，銅綠假單胞菌內的ATP含量。 k Ce-Car NCPs對細菌呼吸鏈復合物I和IV活性的影響。 l 不同濃度Ce-Car@EV NPs對耐藥銅綠假單胞菌藥物外排泵活性的影響。

生物安全性是臨床應用的前提。體外細胞毒性實驗顯示，即使濃度高達512 μg/mL，Ce-Car@EV NPs與L929、RAW 264.7等細胞共培養24小時后，細胞活力仍高于80%，且溶血率低于5%。在體內，注射了Ce-Car@EV NPs的小鼠在7天內體重、體溫、血常規、血清生化指標及主要器官組織切片均未見明顯異常，大腦皮層中的氧化應激標志物也無顯著變化，證明了其優異的生物相容性。

得益于EVs的仿生偽裝，Ce-Car@EV NPs展現了卓越的體內靶向能力。活體成像結果顯示，在感染耐藥銅綠假單胞菌的肺炎小鼠模型中，Ce-Car@EV NPs在感染肺部的富集量遠超未包覆的Ce-Car NCPs，且熒光信號可持續長達24小時。藥代動力學研究表明，其血液循環半衰期達到了6.68小時，主要通過肝臟代謝和腎臟排泄兩條途徑在7天內近乎完全清除，無明顯器官蓄積。

圖5. Ce-Car@EV NPs的體內藥代動力學、生物分布與代謝。 a Ce-Car@EV NPs體內成像流程示意圖。 b 尾靜脈注射Ce-Car NCPs或Ce-Car@EV NPs后不同時間點，耐藥銅綠假單胞菌肺炎小鼠的代表性體內熒光圖像。 c 注射后不同時間點，感染肺區熒光信號強度的定量分析。 d 注射后6小時，主要器官和感染肺組織的熒光圖像。 e 對應d圖的熒光強度定量分析。 f 靜脈注射后指定時間點血液中鈰濃度定量，以及通過非房室模型確定的循環半衰期。 g 注射后7天內不同時間段糞便中排出的鈰質量。 h 注射后7天內不同時間段尿液中排出的鈰質量。

在由耐藥銅綠假單胞菌引起的急性肺炎小鼠模型中，Ce-Car@EV NPs展現了強大的治療潛力。與生理鹽水、游離羧芐青霉素和Ce-Car NCPs處理組在36小時內全部死亡不同，Ce-Car@EV NPs處理組的小鼠存活率顯著提高，且體重、體溫保持穩定，臨床評分也明顯改善。治療后12小時，Ce-Car@EV NPs組小鼠肺組織和支氣管肺泡灌洗液中的細菌載量比其他組降低了2個多數量級，且有效阻止了細菌向心、肝、脾、腎等器官的擴散。治療60小時后，其肺組織中的細菌負荷進一步降低。肺組織切片的免疫熒光染色也直觀地證實了其卓越的殺菌效果。

圖6. Ce-Car@EV NPs對耐藥銅綠假單胞菌誘導的肺部感染的體內治療效果。 a 建立耐藥銅綠假單胞菌誘導的急性肺部感染模型和治療方案的設計。 b 經Car、Ce-Car NCPs或Ce-Car@EV NPs治療的感染小鼠在36小時內的存活率。 c 接受不同治療后，感染小鼠在12小時內體溫的變化。 d 接受不同治療后，感染小鼠在12小時內體重的變化。 e 不同處理后小鼠肺組織的數碼圖像。 f 評估六個參數的臨床評分。 g 治療后12小時，肺勻漿中存活細菌的定量。 h 治療后12小時，支氣管肺泡灌洗液（BALF）中存活細菌的定量。 i 用抗耐藥銅綠假單胞菌抗體染色的肺切片免疫熒光圖像。

通過對肺組織損傷指標的評估，Ce-Car@EV NPs的治療優勢進一步凸顯。該處理組小鼠的肺濕干比（反映肺水腫程度）顯著低于其他感染組，支氣管肺泡灌洗液中的總蛋白濃度和乳酸脫氫酶（LDH）活性也最低，表明其有效減輕了感染引起的肺水腫和組織損傷。H&E染色和Masson染色結果顯示，Ce-Car@EV NPs處理組小鼠的肺組織結構接近正常，炎癥細胞浸潤和纖維化程度最輕，而其他處理組的肺部則表現出明顯的病理損傷。

圖7. Ce-Car@EV NPs對耐藥銅綠假單胞菌誘導的肺炎感染的療效。 a 不同治療組的肺濕干比。 b 支氣管肺泡灌洗液（BALF）中的總蛋白濃度。 c 支氣管肺泡灌洗液（BALF）中的乳酸脫氫酶（LDH）活性。 d 治療后12小時小鼠的肺指數。 e 不同治療組肺切片的代表性H&E染色圖像。 f 不同治療組肺切片的代表性Masson染色圖像。

總結與展望

綜上所述，這項研究成功構建了一種名為Ce-Car@EV的仿生pH響應性納米平臺，通過協同整合姜來源細胞外囊泡與鈰-羧芐青霉素配位納米顆粒，為對抗和逆轉革蘭氏陰性菌的抗菌素耐藥性提供了創新方案。該平臺的核心優勢在于其獨特的雙重作用機制：一方面通過靶向遞送和pH響應釋放，實現抗生素在感染部位的高效富集；另一方面，釋放的Ce??離子通過耗竭細胞內ATP、破壞氧化磷酸化和抑制外排泵活性，從能量代謝根源上“釜底抽薪”，逆轉細菌耐藥性。體內外實驗結果一致證實了其卓越的抗菌效果和良好的生物安全性。這項工作不僅超越了傳統依賴外源能量的系統，直接靶向耐藥性的生理基礎，而且植物源囊泡的免疫調節潛力也為未來的抗感染治療提供了更廣闊的空間，為臨床治療多重耐藥菌感染開辟了一條充滿希望的新途徑。