海南大學《Sci.Adv》：雙模式微流控裝置，實現(xiàn)罕見腫瘤診斷分析雙重突破！

3D打印技術作為先進制造手段，在生物醫(yī)學領域掀起革新，尤其為微流控器件的一體化制備提供了核心技術支撐。對于罕見腫瘤病理切片的研究，樣本稀缺與多維分析需求的矛盾長期存在，而高精度3D打印能精準構建復雜的微通道、反應腔等關鍵微結構，以及快速一次成型自定義的PDMS芯片模具，縮短制樣周期并保證微通道與腔室的高重復性，為開發(fā)低樣本消耗、高集成度的病理分析設備奠定了基礎。針對病理切片與稀有腫瘤樣本的資源稀缺問題，將微流體模塊與高精度3D打印結合，能顯著降低所需切片數(shù)量并提升多通道和多標記的空間分辨率，使得組織切片處理、微量試劑流控與多通道并行檢測在臨床和研究中更加可及，成為破解臨床診斷與科研瓶頸的重要技術。

近日，海南大學的黃振立、史冰團隊在《Science Advances》在線發(fā)表題為“Dual-mode microfluidic immunostaining device for diagnostic biomarkers detection and tumor microenvironment evaluation”的原創(chuàng)性論著，海南大學的博士研究生張瑜為本文第一作者，海南大學的史冰講師和黃振立教授為共同通訊作者。該研究開發(fā)了雙模式微流控免疫染色裝置（Dumi），在1~2張組織切片上實現(xiàn)了免疫組織化學（IHC）標志物診斷流程與腫瘤微環(huán)境（TME）科研分析的一體化，并能構建含多個診斷標志物的空間TME圖譜，便于挖掘腫瘤細胞亞群與其原位微環(huán)境的關聯(lián)性。該文章為罕見腫瘤的精準診斷和TME研究提供了臨床可及的高效解決方案。

首先，研究團隊通過摩方精密的面投影微立體光刻（PμSL）3D打印技術（microArch?S240，精度：10μm），制造了核心部件——3D打印流體交換歧管和微流控芯片模具，其微通道尺寸變異系數(shù)小于1%，確保了裝置的結構一致性與運行穩(wěn)定性。Dumi裝置集成了雙模式染色功能：多通道模式通過16個平行微通道，可同時檢測16種診斷生物標志物；全腔室模式則能完成多輪循環(huán)迭代的免疫熒光染色，構建TME空間圖譜（圖1）。微流控系統(tǒng)的連續(xù)流動設計，將傳統(tǒng)1小時以上的孵育時間縮短至10分鐘，試劑消耗和切片使用量分別減少90%和94%以上，且可兼容常規(guī)顯微成像平臺。

圖1. Dumi裝置結構、工作流程及雙染色模式示意圖。

為提升染色準確性，研究人員以CD20（膜標志物）和Ki67（核標志物）為對象，優(yōu)化了流速和孵育時間（圖2）。結果顯示，4 μL/min流速、10分鐘孵育時，抗原-抗體結合接近飽和（CD20達92%、Ki67達84%），且非特異性背景最低。通過抗體濃度梯度實驗，驗證了在常規(guī)IHC推薦濃度下，Dumi可直接使用現(xiàn)有抗體，無需重新優(yōu)化，兩種抗體的濃度-響應曲線形態(tài)相似，證明方法一致性較好。

圖2. Dumi免疫染色參數(shù)優(yōu)化。

接下來以扁桃體組織CD20染色為模型，對比Dumi全腔室模式與傳統(tǒng)IHC（圖3）。傳統(tǒng)IHC需235分鐘，且存在明顯邊緣效應；Dumi僅需34分鐘，且染色強度分布較為均勻。定量分析顯示，Dumi的信號變異系數(shù)（<9.307%）低于傳統(tǒng)方法（<11.450%），雖信號強度略低，但背景信號更低，信號背景比（SBR）更優(yōu)，證明二者信號提取能力相當，可相互替代。

圖3. 全腔室模式與傳統(tǒng) IHC 的性能對比。

接下來，研究人員采用扁桃體組織驗證雙模式連續(xù)免疫熒光染色策略，通過多通道IF預篩選生物標志物后，經(jīng)光漂白處理再進行全腔室六重免疫熒光染色（圖4）。對三個重復樣本的分析顯示，細胞表型組成高度相似，t-SNE聚類能清晰區(qū)分免疫細胞譜系。驗證了Dumi在復雜流程中的穩(wěn)定性和數(shù)據(jù)可靠性。

圖4. 雙模式連續(xù)染色的重復性與細胞分析。

在臨床應用中，研究團隊將Dumi用于4例彌漫大B細胞淋巴瘤（DLBCL），含1例罕見的原發(fā)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)彌漫大B細胞淋巴瘤（PCNS-DLBCL）。病理診斷結果顯示，通過多通道模式快速完成了自動化的16種生物標志物檢測，并請病理學家進行診斷，亞型診斷結果與病理報告高度一致（圖5）。

圖5. Dumi在臨床DLBCL樣本中的快速診斷應用。

基于PCNS-DLBCL樣本診斷后的剩余單切片，通過全腔室模式構建六重TME圖譜，涵蓋腫瘤細胞、免疫細胞、血管內(nèi)皮細胞等（圖6）。PhenoGraph聚類成功識別出細胞毒性T細胞、輔助 T細胞等群體。空間分析顯示，CD8a?T細胞與腫瘤細胞（CD20?）呈空間排斥關系，Ripley's K分析證實其在10 μm以上存在持續(xù)聚類，揭示了“免疫排斥型”TME特征，為TME研究提供了可重復的分析起點。

圖6. PCNS-DLBCL樣本的TSA多重免疫熒光成像和分析。

最后，研究人員在單一組織切片上實現(xiàn)多通道診斷標志物與全腔室TME圖譜的聯(lián)合分析（圖7）。NND分析顯示，CD20?細胞與GFAP?細胞、CD68?細胞空間距離最近（中位距離8-10 μm）。不同診斷標志物陽性細胞的微環(huán)境存在差異：如MUM1?、Bcl-2?細胞與血管內(nèi)皮細胞富集，c-Myc?細胞則呈排斥；Bcl-6?/CD20?、c-Myc?/CD20?細胞周圍的CD8a? T細胞比例升高，表明特定腫瘤亞群能主動塑造其微環(huán)境生態(tài)位，為個性化診療提供了直觀的空間證據(jù)。

圖7. 診斷生物標志物與TME的聯(lián)合分析示意圖。

總結：Dumi裝置借助摩方精密微納3D打印技術實現(xiàn)核心部件的高精度制備，突破性解決了罕見腫瘤樣本稀缺造成信息獲取不足的技術痛點。其雙模式設計可通過1-2張切片完成16種標志物診斷與TME空間分析，不僅大幅降低樣本消耗，節(jié)省了利用樣本進行單標記預實驗的篩選流程，還建立了診斷生物標志物與原位微環(huán)境的直接關聯(lián)，為解析腫瘤免疫逃逸機制提供了全新方法。該設備兼容現(xiàn)有臨床病理流程，無需復雜操作培訓，為罕見腫瘤的精準診斷、預后評估和個性化治療提供了實用工具，未來有望拓展至原位雜交、空間轉(zhuǎn)錄組等更多生物醫(yī)學應用場景。

https://doi.org/10.1126/sciadv.aea2586

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