藥學1區-if5.4: 柴胡桂枝干姜湯通過抑制腺泡細胞鐵死亡減輕慢性胰腺炎

【寫在前面】：本期推薦的是由天津醫科大學天津市南開醫院急性腹病中西醫結合研究所、天津醫科大學天津市南開醫院超聲科等研究團隊合作近期發表于Journal of Ethnopharmacology(IF5.4）的一篇文章，揭示柴胡桂枝干姜湯通過調節p53/SLC7A11/GPX4通路抑制腺泡細胞鐵死亡減輕慢性胰腺炎。

【期刊簡介】

【題目及作者信息】

Chaihu Guizhi Ganjiang decoction attenuates chronic pancreatitis by suppressing acinar cell ferroptosis via regulating p53/SLC7A11/GPX4 pathway

民族藥理學相關性

柴胡桂枝干姜湯（CGGD）是一種經典中藥復方，已證實對慢性胰腺炎（CP）的胰腺纖維化具有療效。然而，其對于CP其他關鍵病理方面的調節作用尚不清楚。

目的

本研究旨在探討CGGD對CP胰腺腺泡細胞鐵死亡的保護作用，并闡明其潛在機制。

方法

采用二氯二丁基錫（DBTC）誘導4周建立CP大鼠模型，并通過血清分析和組織病理學檢查評估CGGD對胰腺損傷和纖維化的療效。網絡藥理學結合蛋白質組學分析確定了CGGD治療CP的潛在作用靶點。透射電子顯微鏡（TEM）確認了鐵死亡的特征性形態學標志。采用生化測定法檢測組織中丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）水平以及鐵含量。通過RT-qPCR和Western blot檢測鐵死亡的關鍵介質（TFR1、FTH1、SLC7A11、GPX4、p53），并利用免疫熒光進一步確認GPX4和p53的定位。在體外實驗中，使用雨蛙素、CGGD含藥血清（CGGDs）、Nutlin-3a（一種p53激活劑）、Erastin（一種SLC7A11抑制劑）或Trp53 siRNA處理AR42J細胞。使用商用試劑盒、RT-qPCR、Western blot和免疫熒光染色評估炎癥和鐵死亡的關鍵介質。

結果

CGGD顯著減輕了DBTC誘導的CP大鼠的胰腺損傷、細胞死亡和纖維化。機制上，p53和鐵死亡被確定為CGGD在CP中的關鍵作用靶點。具體而言，CGGD在體內和體外均抑制了p53磷酸化，阻斷了鐵死亡通路的激活，并減輕了氧化應激。值得注意的是，在雨蛙素誘導的AR42J細胞中，CGGD誘導的活性氧減少和GSH恢復可被Nutlin-3a或Erastin聯合處理顯著逆轉。此外，在敲低Trp53后，CGGDs減輕鐵死亡和氧化應激的效果并未進一步減弱。

結論

我們的研究結果表明，CGGD通過p53/SLC7A11/GPX4軸抑制胰腺腺泡細胞的鐵死亡，從而闡明了一種CGGD治療CP的新治療機制。

圖文摘要

【前言】

慢性胰腺炎是一種持續性的炎癥性疾病，其特征是進行性的胰腺纖維化和不可逆的實質破壞。目前，尚無治療方法能夠阻止或逆轉其疾病進展。據估計，全球CP的發病率約為每年每10萬人10例。CP的病理生理學主要涉及進行性的腺泡細胞破壞。這會觸發炎癥細胞浸潤，從而導致胰腺星狀細胞活化。隨后，活化的PSCs轉化為肌成纖維細胞樣細胞，沉積細胞外基質蛋白（如膠原蛋白和纖連蛋白），最終導致纖維化。進行性的纖維化取代了功能性腺泡組織，導致外分泌和內分泌功能障礙以及疼痛。最近的研究強調，腺泡細胞損傷是CP進展過程中的起始事件。因此，研究腺泡細胞損傷的新機制對于全面理解CP的發病機制至關重要，并可能提供新的藥物治療靶點。

鐵死亡被定義為一種獨特的程序性細胞死亡形式，在機制和形態上區別于凋亡、壞死和自噬。它主要由鐵依賴的脂質過氧化物和活性氧的積累驅動，導致細胞膜瓦解。該過程涉及兩個主要階段：初始的ROS生成，隨后是鐵死亡的執行。至關重要的是，鐵死亡發生在脂質過氧化、系統Xc?/谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）軸以及鐵代謝的交匯點。研究表明，長期給予右旋糖酐鐵會誘導小鼠胰腺鐵超載，從而觸發鐵死亡，隨后促進腺泡細胞死亡和CP樣功能障礙。與此一致的是，人類CP患者和三硝基苯磺酸（TNBS）誘導的小鼠CP模型均表現出胰腺鐵沉積、鐵死亡活性、纖維化和免疫細胞浸潤。值得注意的是，這些小鼠模型表現出由抗氧化防御不足引起的氧化應激平衡受損，從而使胰腺細胞易于發生鐵死亡。此外，藥理學抑制鐵死亡通路（例如，通過增強GPX4活性）已被證明能有效減輕胰腺纖維化?？傊?，這些發現強調了鐵死亡對CP發病機制的貢獻，并凸顯了其作為治療靶點的潛力。

作為人類癌癥中最常發生突變的腫瘤抑制基因之一，腫瘤蛋白p53在細胞過程中起著關鍵調節作用。越來越多的證據證實其參與了鐵死亡相關的代謝途徑，并將其確定為這種細胞死亡形式的核心調節因子。研究表明，溶質載體家族7成員11，作為系統Xc?胱氨酸/谷氨酸逆轉運蛋白的關鍵組分，在轉錄水平上直接被p53抑制。其機制是，p53與SLC7A11啟動子內的反應元件結合，抑制其表達。這減少了細胞外胱氨酸的攝取，從而限制了GSH的合成。隨之而來的GSH耗竭損害了GPX4的活性，導致脂質過氧化物積累增加，最終觸發鐵死亡。此外，p53直接上調轉鐵蛋白受體1和線粒體鐵輸入蛋白SLC25A28的表達，促進細胞內鐵超載并增強對鐵死亡的易感性。值得注意的是，在CP患者的組織以及相應的小鼠模型中已觀察到p53表達升高。然而，調節p53介導的鐵死亡是否影響CP的發病機制仍有待充分闡明。

根據中醫理論，CP屬于少陽陽明合病，表現為腹痛脅脹，涉及肝、膽、脾功能失調。柴胡桂枝干姜湯源自張仲景的《傷寒論》，正是針對此類證候。CGGD由七味藥材組成：柴胡、桂枝、干姜、黃芩、天花粉、牡蠣和甘草。在當代中醫醫院中，該方劑被廣泛用于治療多種消化系統疾病，包括腸易激綜合征、非酒精性脂肪性肝病、慢性非萎縮性胃炎和胰腺癌。劉渡舟教授進一步發展了這一病機模型，并識別出口苦、便溏等關鍵癥狀，以指導CGGD在CP治療中的應用。我們之前的研究表明，CGGD能顯著改善DBTC誘導的CP大鼠的胰腺損傷和纖維化。然而，CGGD是否通過p53介導的鐵死亡來減輕胰腺腺泡損傷，尚待闡明。

本研究整合了生物信息學分析、體內DBTC誘導的CP大鼠模型以及體外雨蛙素誘導的AR42J細胞模型，系統地研究了CGGD的治療機制。我們證明，CGGD通過抑制腺泡細胞鐵死亡來減輕CP中的胰腺損傷和纖維化。從機制上講，p53被確定為介導CGGD抗鐵死亡作用的關鍵分子靶點。

【結果部分】

1.柴胡桂枝干姜湯化學成分的UHPLC-Q-orbitrap MS分析。

2.柴胡桂枝干姜湯減輕大鼠慢性胰腺炎損傷。

3.基于網絡藥理學的柴胡桂枝干姜湯治療慢性胰腺炎機制分析。

4.柴胡桂枝干姜湯對慢性胰腺炎治療作用的蛋白質組學分析。

5.柴胡桂枝干姜湯抑制DBTC誘導的慢性胰腺炎中鐵死亡的發生。

6. 柴胡桂枝干姜湯抑制慢性胰腺炎中的p53表達。

7.CGGD含藥血清減輕雨蛙素誘導的AR42J細胞鐵死亡。

8.CGGD含藥血清抑制雨蛙素誘導的AR42J細胞中p53的表達。

9.CGGD含藥血清通過抑制p53/SLC7A11/GPX4信號通路介導的鐵死亡減輕雨蛙素誘導的AR42J細胞損傷。

【結論與討論】

綜上所述，本研究證實，柴胡桂枝干姜湯（CGGD）通過p53/SLC7A11/GPX4信號通路抑制腺泡細胞鐵死亡，從而減輕慢性胰腺炎（圖11）。通過整合網絡藥理學、蛋白質組學及實驗驗證，我們闡明了CGGD對抗CP進展的作用機制。我們的研究結果確定p53為CGGD的關鍵分子靶點。研究發現，CGGD通過抑制p53的過度活化（主要通過減少其第15位絲氨酸的磷酸化）來抑制鐵死亡。此外，無論是激活p53還是抑制SLC7A11，均能顯著逆轉CGGD的抗鐵死亡作用。這些發現證實，CGGD通過p53/SLC7A11/GPX4通路減輕鐵死亡，從而揭示了其核心作用機制，為靶向鐵死亡治療CP提供了新的治療策略。

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