EMBO Mol Med?|?郭天南團隊發現血液蛋白質組污染現象并建立評估方法

2025 年 12 月 5 日，西湖大學醫學院 郭天南 團隊，聯合浙江大學醫學院第一附屬醫院 徐鶴云 教授等多個團隊，在EMBO Molecular Medicine發表最新研究Systematic evaluation of blood contamination in nanoparticle-based plasma proteomics，系統揭示了血小板、紅細胞和凝血等污染對血漿蛋白質組分析的影響，并開發出解決方案——高通量OmniProt與自動化開源質控軟件“白澤(Baize) ” ， https://www.guomics.com/Baize 。

基于傳統前處理方法聯合質譜技術的血液樣本蛋白質檢測，通常可鑒定出約 300 至 1000 種蛋白質。近年來，隨著納米顆粒（ nanoparticle, NP ）與質譜聯用技術的發展，血漿蛋白質組的鑒定數量顯著提升。然而在實際研究中發現，即便采用相同的質譜采集與分析流程，不同實驗間的蛋白質鑒定數目仍存在顯著波動，范圍可達 2000 至 8000 個不等。是否蛋白質數量越高越好呢？針對這一重復性與穩定性難題，郭天南團隊通過深入分析發現，血小板與紅細胞污染是導致血漿中蛋白質鑒定數量異常升高的關鍵因素。在此基礎上，團隊系統評估了包括血小板、紅細胞及凝血相關污染對基于納米顆粒的血漿蛋白質組學分析的影響，進一步確認血小板與紅細胞污染不僅是造成蛋白質鑒定數目增加的主要原因，也是影響蛋白質定量結果可靠性的重要干擾因素之一。

基于納米顆粒的血漿蛋白質組學技術在提升蛋白鑒定深度方面展現出巨大潛力。然而，可能存在的血小板、紅細胞殘留或凝血不全等問題是數據異常的潛在根源，這些問題長期被學界忽視。這些污染不僅會導致蛋白鑒定數量的波動很大，從 2000-8000 個蛋白質不等，更會嚴重影響低豐度蛋白的定量準確性，給后續的生物標志物發現和疾病診斷帶來嚴重偏差。研究團隊通過嚴謹的科學實驗，建立了經過全面優化的高通量、高靈敏度血漿蛋白質組學流程 OmniProt 并開發了開源自動化軟件白澤 (Baize) ，實現了對三類血液污染的快速評估；同時構建了覆蓋 10,109 個蛋白組的血漿譜圖庫，為后續 DIA 分析提供了數據支撐。

圖 1 本研究建立了 OmniProt 前處理流程及白澤 (Baize) 軟件評估血漿樣本污染程度

研究團隊從源頭出發，系統比較了包括實性、介孔、空心介孔及分級孔結構在內的多種二氧化硅納米顆粒。在肺部疾病患者血漿樣本的重復分析中，所有納米顆粒之間鑒定的蛋白質種類重疊超過 80% ，且實驗重復性良好。最終，直徑 500 nm 的實性納米顆粒（ NP23 ）被用于后續工作。確立納米材料后，團隊對血漿稀釋、形成蛋白冠、洗脫條件等關鍵參數進行了系統優化。研究發現，堿性緩沖液（ pH 11 ）顯著提高了蛋白與肽段的鑒定數量，分別在原有基礎上提升 12% 與 36% 。通過掃描電鏡觀察，該條件下顯示出穩定的納米顆粒結構與蛋白冠。在確定 0.5 mg 納米顆粒用量、 30 分鐘孵育時間的基礎上，團隊進一步優化了洗滌流程，確定三次洗滌及 7000 g 離心條件能有效去除軟蛋白冠。這些系統性的優化工作為 OmniProt 流程的標準化奠定了堅實基礎，確保其在血漿蛋白質組學應用中保持較好的穩定性與重復性。

研究將 OmniProt 與市面上商品化的 Top14 高豐度蛋白去除試劑盒（ Top14 ）及傳統直接酶解（ Neat ）方法進行比較。結果證實， OmniProt 在蛋白質組與肽段鑒定數量上均表現顯著優勢：其蛋白鑒定數分別為 Top14 方法的 1.7 倍和 Neat 方法的 4.8 倍；肽段鑒定數分別為 Top14 方法的 2.6 倍和 Neat 方法的 5.7 倍。該平臺顯著增強了對低豐度蛋白質的檢測能力。此外，在人 - 牛混合樣本的交叉物種定量準確性評估實驗中， OmniProt 在檢測蛋白數量優于傳統直接酶解方法，定量準確性方面與 Neat 條件下基本一致。三種條件下的生物學重復之間的變異系數中位數低于 20% ，證實了該流程的高準確性與高重復性。

為支持精準的定量分析，研究團隊利用 21 種化學特性不同的納米顆粒對肺部疾病患者的血漿樣本進行蛋白質富集，并通過高 pH 反相色譜將肽段分為 30 或 60 個組分，進而進行 Astral nDIA 分析，共計生成 780 個 DIA 數據文件。經過 DIA-NN 分析，最終建立了包含 126,661 個肽段離子、對應 10,109 個蛋白組的血漿譜圖庫。該數據庫不僅覆蓋了人類血漿蛋白質圖譜（ HPA ）中 94% 的蛋白，還顯示出多種 NP 性能（如電荷、官能團、親水 / 疏水性）對蛋白吸附性能差異。功能富集分析表明，這些蛋白涉及信號轉導、凋亡、蛋白磷酸化、細胞粘附及先天免疫等多個生物過程，該譜圖庫包含神經退行性疾病、代謝通路及腫瘤通路的相關蛋白。

基于 OmniProt 流程獲取的高質量數據，研究團隊首次系統鑒定出三類污染的特異性標志物。針對血小板污染，團隊構建了 PRP （富血小板血漿）與 PPP （貧血小板血漿）的混合梯度樣本，通過 Mfuzz 聚類與相關性分析，篩選出 30 個與血小板污染程度高度相關的新標志物（ Spearman r > 0.92 ）。這些標志物涵蓋了大量血小板功能相關蛋白，并通過 12 例患者樣本驗證了其可靠性。在紅細胞污染方面，研究人員設計了紅細胞 -PPP 混合梯度模型，從高相關性（ r > 0.98 ）蛋白中篩選出 30 個與紅細胞污染相關的新標志物，涵蓋血紅蛋白、細胞膜骨架及氣體轉運蛋白，具有明確的生物學特異性。六例患者的稀釋梯度實驗進一步驗證了這些標志物的準確性。對于凝血相關污染，研究比較了使用三種不同采血管（ EDTA 、檸檬酸鈉、肝素鋰）采集的樣本，實驗發現：盡管蛋白鑒定數目無明顯差異，但僅 59.2% 的蛋白質在三種抗凝劑中同時被檢測到。通過篩選上下調顯著的蛋白，團隊確定了 20 個與凝血相關的污染標志物 ( 如 FGA 、 FGG 、 FGB 、 AGGF1 、 TFRC) ，并將其整合為凝血污染評估模型。基于這些發現，研究團隊開發了名為白澤 (Baize) 的網頁工具，用于快速評估 NP 富集血漿樣本中的三類關鍵污染。軟件通過計算每類污染標志物信號強度與總蛋白信號之比，生成污染指數。用戶只需上傳蛋白表達矩陣，白澤 (Baize) 即可自動輸出各樣本的污染狀態。該工具已免費開放，訪問地址為 ： https://www.guomics.com/Baize

為驗證 OmniProt 和白澤 (Baize) 的實際應用價值，研究團隊分析了 199 例肺結節患者（含良性、早期惡性及 6 例晚期對照）的血漿樣本。所有樣本采用 OmniProt 流程處理后進行 Astral 質譜儀的 nDIA 方法采集數據，共鑒定出約 4413 個蛋白質，實驗重復性高。通過白澤 (Baize) 檢測，研究團隊成功識別出 5 例存在明顯污染的樣本，并將其從后續分析中剔除，確保了數據的可靠性。在獲得高質量數據的基礎上，研究人員采用 8 種機器學習算法對良惡性結節進行分類。結果顯示， Extra Trees 模型在 F1 分數、準確率、召回率及 AUC 方面表現最優。該模型最終篩選出與肺癌相關的關鍵蛋白如 FSCN1 、 PDGF 、 FCGR3A 、 HAMP 、 COL15A1 等，表明基于 OmniProt 和白澤 (Baize) 獲得的蛋白組數據具備區分肺癌病理狀態的潛力。

本研究系統闡明了血液成分污染對納米顆粒蛋白質組學的深遠影響。

OmniProt 流程通過對納米顆粒篩選和實驗條件的全面優化，實現了高通量、高靈敏度的血漿蛋白質組分析；白澤 (Baize) 軟件則通過智能算法，為樣本質量評估提供了可靠標準；而高質量譜圖庫的構建，為領域內的后續研究提供了寶貴資源。

本研究也存在一些局限性，例如所采用的非磁性納米顆粒依賴多次離心操作，限制了工作流程的自動化程度與臨床轉化效率。同時，受限于試劑與成本，未能與當前所有主流納米顆粒方法進行全面平行對比。研究人員指出，還需要獨立隊列對現有肺癌早篩模型篩選出的蛋白做進一步驗證。

近期，德國馬克斯 · 普朗克生物化學研究所的 Philipp E. Geyer 與 Matthias Mann 團隊在EMBO Molecular Medicine上發表了與我們相關的工作，系統比較了五種血漿蛋白質組前處理方法。他們的工作同樣指出，磁珠富集技術雖能提升檢測深度，但也易受污染干擾，并提出了相應優化策略。這一平行研究呼應了我們在污染控制與數據可靠性方面的關注。

西湖大學醫學院博士生高歡歡，西湖歐米詹越城、浙江大學醫學院附屬第一醫院醫生劉元奇博士為該研究共同第一作者。西湖大學醫學院郭天南教授、西湖實驗室朱怡研究員、浙江大學醫學院附屬第一醫院徐鶴云教授和苗惠文教授為共同通訊作者。

文章來源：

https://link.springer.com/article/10.1038/s44321-025-00346-9

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