《食品科學》：鄒偉副教授：串聯質譜標簽定量蛋白質組學解析產酯酶Pichia kudriavzevii混菌發酵代謝機制

白酒是中國傳統蒸餾酒。因其不同的風味口感，白酒可分為12 種香型，其中濃香型白酒在白酒銷售市場中占比最高，達到70%。濃香型白酒馥郁濃香、回味悠長，其呈味物質主要來源于微生物發酵中產生的有機酸、酯類、高級醇以及羰基化合物。白酒中風味物質的形成與釀造環境中微生物群落密切相關，而酵母菌作為其中的關鍵微生物，其作用不容忽視。

庫德里阿茲威畢赤酵母（Pichia kudriavzevii），又稱東方伊薩酵母，在自然界分布廣泛，被廣泛應用于白酒發酵過程。在前期研究中，本實驗室篩選到一株高產酯化酶P. kudriavzevii，產酯酶能力為33.3 U/mL。同時發現，該菌和丁酸梭菌（Clostridium butyricum）在混菌發酵條件下產酯總量達到1.932 g/L，二者具有較好的協同產酯能力。

近年來，隨著蛋白質組學技術的飛速發展，基于串聯質譜標簽（TMT）的定量蛋白質組學技術因其通量高、誤差小、靈敏度高的優勢，在蛋白質組學研究中廣受歡迎。

四川輕化工大學生物工程學院的蔡嶺肸、劉春艷、鄒偉*等人以P. kudriavzevii作為研究對象，利用TMT定量蛋白質組學技術分析其單菌發酵、與C. butyricum混菌發酵之間的蛋白質組學差異。在蛋白水平上，系統解析單菌和混菌發酵時的生長代謝機制差異，以期為調控該混菌發酵系統提供一定理論參考。

1 單菌與混菌培養發酵產物分析

如圖2所示，總體上，單菌發酵所產生的酸、醇、酯類代謝物質的產量低于混菌發酵。以乙醇為例，JM5-4單菌發酵產量在1.598 g/L，GD1-1單菌發酵產量為1.7 g/L，而混菌發酵卻達到了2.396 g/L，幾乎是JM5-4單菌發酵和GD1-1單菌發酵的1.50、1.41 倍。對于酸類物質，JM5-4單菌發酵產物主要是乙酸（產量為0.108 g/L），而與GD1-1混菌發酵后，乙酸的產量顯著提升至0.425 g/L，約為JM5-4單菌發酵產量的4.0 倍。混菌發酵正丁酸和正己酸的產量分別為1.345 g/L和0.721 g/L，相較于GD1-1單菌發酵（正丁酸為1.042 g/L，己酸為0.679 g/L）分別提高了約29%和6%。JM5-4單菌發酵主要產乙酸乙酯（0.278 g/L），GD1-1單菌發酵為0.424 g/L，而混菌發酵乙酸乙酯產量為0.544 g/L，分別為單菌發酵的2.0、1.3 倍。并且在混菌發酵后，酯類物質更為豐富，總酯產量更高。意外的是，JM5-4在混菌發酵時產生了0.928 g/L的甲醇，是單菌發酵所沒有的。推測是C. butyricum GD1-1產生該物質。甲醇作為GD1-1單菌發酵的產物時，其產量為1.407 g/L，明顯高于混菌發酵，約為1.5 倍。因此，可以認為在混菌發酵條件下，對C. butyricum GD1-1甲醇的合成具有抑制作用。總體而言，將JM5-4與GD1-1進行混菌發酵，促進了代謝物產量，并使其代謝產物更加豐富。

2 蛋白質鑒定與定量分析

如圖3A所示，二級譜圖總數為532 875 張，數據庫匹配蛋白譜圖為56 168 張；肽段總數為22 220 個，唯一肽段總數為20 777 個；鑒定到的蛋白質總數為3 164 個，可定量蛋白有3 164 個。如圖3B所示，以差異倍數（fold change，FC）＞1.2且P＜0.05為標準（顯著下調的蛋白質以藍色標注（FC＜0.83且P＜0.05），顯著上調的蛋白質以紅色標注（FC＞1.2且P＜0.05），無差異的蛋白質為灰色）篩選得到組間共有355 個差異表達蛋白（differentially expressed proteins，DEPs），包括上調蛋白159 個、下調蛋白質196 個。采用層次聚類算法對各組的DEPs進行相似性分析，如圖3C所示，單菌發酵組（J）中DEPs上調與下調表達相似，混菌發酵組（JG）的DEPs表達相似；JG組內（JG1、JG2和JG3）以JG1與JG2差異表達相似度最高，J組內（J1、J2和J3）J1與J3差異表達相似度最高。

3 JM5-4全蛋白組學注釋與分析

基于GO與KEGG注釋，在JM5-4的單菌與混菌培養下，總共注釋到3 164 個蛋白質信息，包括355 個DEPs、87 個代謝通路。

GO進行功能注釋總共得到3 164 個蛋白、355 個DEPs，包含生物過程735 個（涉及細胞過程207 個、代謝過程207 個、生物調控67 個等），分子功能369 個（涉及催化活性160 個、結合功能148 個、結構分子活性25 個等）和細胞組分898 個（涉及細胞199 個、細胞組分196 個、細胞器162 個、細胞器組分89 個等）。采用Fisher精確檢驗對DEPs進行GO功能富集分析，結果如圖4所示。檸檬酸循環、藥物代謝過程、小分子代謝過程、細胞質大核糖體亞基、細胞質核糖體、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸結合、氧化還原酶活性等定位蛋白質發生了顯著變化。利用CELLO軟件將鑒定到的DEPs進行亞細胞定位，有257 個蛋白被定位到8 個不同的細胞器。如圖5所示，其分布于細胞質129 個、線粒體91 個、細胞核19 個、周質5 個、細胞膜9 個、胞外2 個和液泡、過氧化物酶體各1 個。

基于KEGG通路注釋，355 個DEPs被注釋到，結果如圖6A所示，DEPs主要集于個關鍵的代謝通路，包括氧化磷酸化、輔因子的生物合成、三羧酸循環、糖酵解/糖異生等，對JM5-4的生長與代謝具有重要影響。對DEPs進行富集分析，結果如圖6B所示。三羧酸循環、氧化磷酸化、果糖和甘露糖代謝、鏈霉素的生物合成以及新霉素、卡那霉素和慶大霉素的生物合成等重要通路發生了顯著變化。如圖6C所示，上調DEPs主要涉及通路包括三羧酸循環、乙醛酸與二羧酸代、硫辛酸代謝等，下調DEPs涉及的通路包括阿特拉津降解、細胞周期、硫胺素代謝、RNA聚合酶等。圖6D展示了DEPs在各代謝通路中的分布情況。其中丙酮酸代謝通路共注釋到7 個DEPs，氧化磷酸化通路注釋到20 個DEPs，而三羧酸循環通路則注釋到13 個DEPs。

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P. kudriavzevii

在糖酵解/糖異生途徑中，參與代謝的4 種DEPs包括葡萄糖-6-磷酸異構酶（EC: 5.3.1.9）、果糖-1,6-二磷酸酶（EC: 3.1.3.11）、磷酸甘油酸變位酶（EC: 5.4.2.11）和乙醇脫氫酶（EC: 1.1.1.2）均表現為下調。同時，己糖激酶（EC: 2.7.1.1）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（EC:1.2.1.12）、丙酮酸脫氫酶（EC: 1.2.4.1）和醛脫氫酶（EC: 1.2.1.3）的DEPs則呈現上調狀態。在三羧酸循環中，檸檬酸合酶（EC: 2.3.3.1）、烏頭酸鹽水合酶（EC:4.2.1.3）、富馬酸水合酶（EC: 4.2.1.2）及蘋果酸脫氫酶（EC: 1.1.1.37）等相關DEPs均上調。此外，在乙醛酸及二羧酸代謝過程中，羥基丙酮酸還原酶（EC: 1.1.1.81）和乙醛酸還原酶（EC: 1.1.1.79）等DEPs也全數上調。由此可以認為JM5-4的混菌發酵（JG組）能有效促進碳水化合物代謝。涉及氧化磷酸化路徑的12 個DEPs，如NADH-醌氧化還原酶（EC: 7.1.1.2）、琥珀酸脫氫酶（EC:1.3.5.1）、細胞色素還原酶（EC: 7.1.1.8）、F型質子泵ATP酶（EC: 7.1.2.2）和細胞色素氧化酶（EC: 7.1.1.9）等均上調，而細胞色素c氧化酶（COX）4、COX17、ATP酶H＋轉運V0亞基A（ATPeV0A）和ATP酶H＋轉運V1亞基G（ATPeV1G）等4 個DEPs則下調。這表明JM5-4的混菌發酵對能量代謝具有顯著的促進作用。在氨基酸代謝方面，涉及甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝、精氨酸生物合成、丙氨酸-天冬氨酸代謝以及半胱氨酸和蛋氨酸代謝的多個DEPs（如羥基丙酮酸還原酶（EC: 1.1.1.81）、絲氨酸-靛醇酸轉氨酶（EC: 2.6.1.45）、絲氨酸-丙酮酸轉氨酶（EC: 2.6.1.51）、乙酰谷氨酸激酶（EC: 2.7.2.8）、N-乙酰-γ-谷氨酰基磷酸還原酶（EC: 1.2.1.38））大部分呈現上調，僅少數（蘇氨酸醛縮酶（EC: 4.1.2.48）和5-氨基左旋酸合酶（EC: 2.3.1.37））為下調，表明混菌發酵能有效地促進氨基酸代謝。再者，在脂質代謝方面，涉及甘油脂代謝和脂肪酸降解的DEPs（例如醛脫氫酶（EC: 1.2.1.3））均呈現上調。酯酶（如S-甲酰谷胱甘肽水解酶（SFGH）（EC: 3.1.2.12）、核糖核酸酶（EC: 3.1.26.4）和海藻糖磷酸酶（EC: 3.1.3.12））的DEPs也均呈現上調，表明混菌發酵對JM5-4的部分產酯酶活性具有積極作用。

基于所得的注釋信息，繪制JM5-4（JG組）的代謝路徑，如圖7所示，代謝途徑相關酶如表1所示，對通路中的DEPs進行標記，如表2所示。在糖酵解/糖異生途徑中，相關酶上調DEPs與下調DEPs數量基本相當，這表明該途徑所生成的丙酮酸等代謝產物并未受到混菌培養（JG組）的顯著影響。隨后，在丙酮酸脫氫酶（EC: 1.2.4.1）的催化下，丙酮酸被轉化為乙酰輔酶A，并生成二氧化碳。同時，該酶的DEPs表現為上調，促進了乙酰輔酶A的大量積累。乙酰輔酶在乙酰輔酶合成酶（EC: 6.2.1.1）的催化下轉化為更多的乙酸，又在乙酰谷氨酸激酶（EC: 1.2.1.3，DEPs上調）的催化下加速了乙醛與乙酸的合成。然而，由于乙醇脫氫酶（EC: 1.1.1.2）的DEPs下調，可能會對乙醇和乙醛的合成產生一定的消極影響。在檸檬酸循環中，所有相關酶的DEPs均表現為上調，促進了通路中的代謝產物生成，進而在碳水化合物代謝中發揮了關鍵作用，參與細胞呼吸和能量生成過程，有效促進了細胞代謝的進行。丙酮酸在丙酮酸羧化酶（EC: 6.4.1.1）的催化下轉化為草酰乙酸，進而通過2-異丙基丙二酸合成酶（EC: 2.3.3.1，DEPs上調）的催化，生成大量檸檬酸。同樣地，在相關酶（DEPs上調）的催化下，混菌培養（JG組）中JM5-4的代謝產物（如順勢烏頭酸、異檸檬酸、乙醛酸、草酰琥珀酸、戊二酸、琥珀酸、富馬酸及蘋果酸）相較于單菌培養（J組）均顯示出一定的提升，并伴隨CO2產量的增加，在發酵過程中產生大量氣體。此外，JG組與J組相比，由其他酶（DEPs無明顯變化）催化生成的代謝產物在數量上無顯著差異。

另外，根據代謝通路，甲基草醛在D-乳酸脫水酶（EC: 4.2.1.130）的催化下能夠代謝生成D-乳酸，而乙酰輔酶A在高檸檬酸合酶（EC: 2.3.3.14）的催化下生成高檸檬酸，但這些物質在前期實驗中并未被檢測到。同樣，盡管在前期實驗中能夠檢測到JM5-4代謝生成的丁二醇與16酸，但測得其在發酵液中的含量較低。因此，可以推測乳酸和高檸檬酸在發酵液中的含量過低，由于誤差存在導致未能被檢測出。

濃香型白酒的生產依賴于多種微生物的共同參與，其代謝產物是白酒風味的主要來源，不同微生物之間的相互作用能顯著影響白酒的品質。目前，混菌發酵成為白酒領域的熱門話題，與單菌發酵相比，多菌株混合發酵能顯著增強白酒的風味。例如，在豉香型白酒中引入P. anomala和Lactobacillus plantarum混合發酵，能有效增強其風味；利用P. kudriavzevii和Saccharomyces cerevisiae混合發酵能顯著提高濃香型白酒發酵中其他微生物的乳酸耐受性。將S. cerevisiae和Wickerhamomyces anomalus以特定比例混合發酵，能顯著提高醬香型白酒中乙酸乙酯的含量。然而，當前的研究主要集中在混菌發酵對風味成分的影響，尚未深入探討產酯酶菌株在混菌發酵中的代謝變化機制。本研究將產酯酶的菌株P. kudriavzevii與產己酸的菌株C. butyricum進行混菌發酵，并利用TMT定量蛋白質組學技術對JM5-4進行分析。結果表明，與單菌發酵相比，JM5-4在混菌發酵過程中的生長與代謝能力顯著提升，其產酯酶能力也有所增強。

JM5-4在混菌發酵過程中，三羧酸循環和二羧酸及乙醛酸循環相關酶的全部DEPs表達上調，有效提升了其生長代謝水平和繁殖能力。伴隨著代謝流速的提高，JM5-4對底物（如糖類）的轉化利用效率也得到了強化，同時促進了二次代謝物（有機酸、香味物質等）的合成。值得注意的是，高濃度的有機酸可能導致質子與陰離子平衡的破壞，從而影響細胞膜、核糖體RNA、DNA以及酶的功能，從而阻礙微生物的正常生長和代謝。

P. kudriavzevii JM5-4展現出良好的酯酶合成能力。在混菌發酵后，部分酯酶相關DEPs的表達上調，從而顯著提升了酯酶的合成能力。酯酶能夠催化脂肪酸和醇的轉化生成酯類化合物，酯酶的上調可能增強香氣成分的合成，從而影響白酒的質量。核糖核酸酶（EC: 3.1.26.4）是一種磷酸單酯水解酶，具有修飾基因的功能，能影響各種類型的編碼和非編碼RNA的成熟。在細胞的多種生物過程中發揮關鍵作用，包括DNA的復制、修復以及RNA的處理。JG組涉及核糖核酸酶的DEPs上調，表明混菌發酵能促進核糖核酸酶的合成，加速細胞代謝。海藻糖-6-磷酸磷酸酶（EC: 3.1.3.12）能催化水解反應去除磷酸基團，形成海藻糖。該酶的DEPs上調，表明混菌發酵促進海藻糖磷酸酶的合成，從而催化多糖合成與能量代謝。SFGH（EC: 3.1.2.12，酯酶D）是一類能夠水解羧酸酯鍵的酶，具有多態性，能催化S-甲酰谷胱甘肽水解成甲酸鹽和谷胱甘肽，對含有硫酯鍵和酯鍵的底物具有更廣泛的酯酶活性。研究表明，SFGH在真核生物和原核生物的甲醛解毒中發揮作用，被認為參與谷胱甘肽依賴性甲醛氧化途徑。本研究發現，JG組涉及SFGH的DEPs全部上調，可能意味著混菌發酵會加速SFGH的合成，從而促進甲酸鹽與谷胱甘肽的生成、催化谷胱甘肽依賴性甲醛氧化，以降低環境來源或甲醇代謝產生的甲醛含量。在釀酒發酵過程中，微生物代謝產生過多的甲醇及甲醛含量會影響白酒的良好風味品質，而SFGH的合成可很好地解決這一問題，表明混菌發酵能減少白酒釀造過程中所產生的有害物質，為白酒的質量控制提供一定理論基礎。

結論

P. kudriavzevii JM5-4單菌發酵（J組）與混菌發酵（JG組）總共鑒定到3 164 個蛋白，355 個DEPs，其中包括糖酵解/糖異生（己糖激酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、丙酮酸脫氫酶、醛脫氫酶）、三羧酸代謝（檸檬酸合酶、烏頭酸鹽水合酶、富馬酸水合酶、蘋果酸脫氫酶等）、乙醛酸和二羧酸代謝（羥基丙酮酸還原酶、乙醛酸還原酶等）在內的DEPs全部上調，表明該菌在混菌發酵條件下其生長代謝能力顯著提升，還能促進酸類物質的合成。核糖核酸酶與海藻糖磷酸酶的大量合成同樣促進了菌株細胞代謝與能量代謝。此外，SFGH的大量合成促進了甲酸鹽與谷胱甘肽的生成，加速甲醛的氧化，能顯著提升白酒的風味品質與安全。綜上，本研究為探究白酒釀造過程中混菌發酵的代謝機制及其對風味品質的影響提供了一定的理論方法，對未來的應用與研究方向具有積極的推動作用。后續研究可以聚焦于優化這些代謝途徑在實際釀造過程中的應用，以進一步提升白酒的風味特性和整體品質。

本文《串聯質譜標簽定量蛋白質組學解析產酯酶

Pichia kudriavzevii

實習編輯：王雨婷；責任編輯：張睿梅。點擊下方閱讀原文即可查看全文。圖片來源于文章原文及攝圖網