神經環路應用（38）丨Split-Cre 重組系統在神經環路中應用

Split-Intein介導的 split-Cre 重組系統是一種高時空精度、環路特異性的基因操作工具，廣泛應用于神經環路功能研究。split-Intein 介導的split-Cre重組系統是基于 “蛋白質反式剪接” 和 “病毒雙向靶向轉導” 的雙重特異性調控策略，核心目標是讓有活性的 Cre 重組酶僅在 PFC（前額葉皮層）投射至 BLA（基底外側杏仁核）的單向回路神經元中表達，從而實現 Shank3 基因的回路特異性敲除。

原理

split-Cre 的片段化設計、Intein 的蛋白質反式剪接功能、AAV 病毒的雙向靶向轉導特性，三者協同確保基因操作的回路特異性。

1. split-Cre 與 Intein 的核心功能

split-Cre（片段化 Cre 重組酶）：Cre 重組酶是介導 loxP 位點間 DNA 重組的關鍵工具，但完整 Cre 僅需表達即可發揮作用，無法實現 “區域/回路限制”。研究將Cre重組酶拆分為N 端片段（CreN）和C端片段（CreC），單獨表達的 CreN 或 CreC 均無酶活性，只有二者重新組裝為完整 Cre 時才能識別 loxP 位點并介導基因敲除。

Intein（內含肽）的反式剪接功能：Intein 是一類可在蛋白質水平上自我剪接的氨基酸序列，分為 N 端 Intein（InteinN）和 C 端 Intein（InteinC）。當 InteinN 與 CreN 融合（CreN-InteinN）、InteinC 與 CreC 融合（InteinC-CreC）時，InteinN 與 InteinC 可通過自身的 “反式剪接” 特性相互識別并形成復合物，同時將 CreN 與 CreC 通過肽鍵連接組裝為有活性的完整 Cre 重組酶，而 Intein 自身則剪接脫離，不影響Cre的功能（這一過程稱為 “蛋白質反式剪接”）。

2. AAV病毒的雙向靶向轉導特性

順行 AAV（AAV8-CreN-InteinN）：

AAV8 血清型具有順行轉導特性，病毒注射至神經元胞體所在腦區（如 PFC）后僅在注射區神經元胞體內表達目的基因（CreN-InteinN），且表達產物（蛋白質）僅隨軸突運輸至末梢，不會跨突觸傳遞至下游腦區，確保 CreN-InteinN 僅存在于 PFC 神經元中。

逆行 AAV（AAV retro-InteinC-CreC）：

逆行 AAV 是經過改造的 AAV 血清型（如 AAVretro）具有逆行轉導特性，病毒注射至神經元軸突末梢所在腦區（如BLA）后，會被軸突末梢攝取并逆向運輸至神經元胞體，僅在投射至BLA的神經元胞體內表達目的基因（InteinC-CreC），確保InteinC-CreC僅存在于向 BLA 投射的神經元中。

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3. 回路特異性實現邏輯

只有同時滿足以下兩個條件的神經元，才能組裝出有活性的 Cre 重組酶：

位于 PFC 腦區（表達 CreN-InteinN，來自順行 AAV8 注射）；向 BLA 腦區投射（表達 InteinC-CreC，來自逆行 AAVretro 注射）。這兩個條件的交集恰好是 PFC 投射至 BLA 的單向回路神經元。只有這類神經元中，CreN-InteinN 與 InteinC-CreC才能通過 Intein 反式剪接組裝為完整 Cre，進而介導 Shank3 基因敲除；其他腦區神經元（如 PFC 不向 BLA 投射的神經元）僅表達單一Cre片段，無法形成活性Cre從而實現回路特異性。

split-Intein 介導的 split-Cre 重組系統結合 AAV 病毒的雙向轉導實現回路特異性敲除：①向 PFC 注射順行 AAV8-CreN-InteinN 病毒，使其在 PFC 神經元胞體表達 N 端 Cre-Intein 融合蛋白（CreN-InteinN）；②向 BLA 注射逆行 AAV retro-InteinC-CreC 病毒，使其在 BLA 神經元軸突末梢表達 C 端 Intein-Cre 融合蛋白（InteinC-CreC）；③僅在 PFC 投射至 BLA 的單向回路神經元中，CreN 與 CreC 通過 Intein 介導的重組形成有活性的 Cre 酶，進而敲除條件性敲除小鼠（Shank3?????）的 Shank3 基因；同時，通過 Ai-14 Cre 報告小鼠的 tdTomato 信號，驗證 Cre 僅在 PFC-BLA 回路中表達。

優勢

傳統全腦 Shank3 敲除會導致多個腦區（如紋狀體、海馬）的基因缺失，難以區分是哪個腦區或回路的突變導致社交障礙；而回路特異性敲除可精準定位 PFC-BLA 回路，排除其他腦區/回路的干擾，明確該回路中 Shank3 突變與社交行為的直接因果關系，提高研究的空間特異性和機制解析的精準度。

案例簡析

Fig1 PFC-BLA回路特異性Shank3敲除對神經元形態的影響

回路特異性 Cre 表達驗證：

通過向 Shank3f/f:Ai-14 小鼠的 PFC 注射 AAV8-CreN-InteinN、BLA 注射 AAV retro-InteinC-CreC僅在 PFC-BLA 單向投射神經元中檢測到 tdTomato 信號（Cre 報告信號），證實 Cre 僅在目標回路中活性實現 Shank3 特異性敲除；

神經元形態異常：

3D 重建分析顯示，ctMUT 小鼠 PFC神經元的初級樹突數量減少，樹突棘密度增加、長度縮短、頭部尺寸減小，明確回路特異性 Shank3 敲除導致的形態學缺陷。

選擇該系統實現回路特異性敲除原因

高特異性：相比傳統區域特異性Cre小鼠（如 PFC-Cre 小鼠，可能在PFC非 BLA 投射神經元中也表達Cre），該系統通過順行+逆行 AAV+Intein剪接的雙重限制，實現了回路水平的精準靶向，避免其他腦區/神經元的干擾。

靈活性高：無需構建復雜的轉基因小鼠品系，僅通過病毒注射即可快速實現不同回路的特異性基因操作，適用于多種神經回路研究。

可擴展性強：除了 Cre 重組酶，該系統還可用于表達其他功能蛋白（如鈣指示劑 GCaMP7f、光敏感通道 ChR2），實現回路特異性的神經活動監測或光遺傳學調控（如研究中同時用該系統表達 GCaMP7f 監測 PFC-BLA 回路鈣信號）。

總結

從分子、細胞、行為學層面檢測 Shank3 敲除效果，分子水平通過 RT-PCR 和 Western Blot 驗證 PFC-BLA 回路中Shank3 mRNA 與蛋白表達降低；

細胞水平借助共聚焦 3D 重建分析神經元形態異常（樹突數量減少、樹突棘密度增加等）；

通過全細胞膜片鉗記錄 mEPSC/mIPSC 驗證突觸傳遞失衡（興奮性增強、抑制性減弱）；

可結合行為學水平例如：利用圓形社交場域（RSA）測試觀察社交缺陷（總嗅探時間、S 區停留時間等指標降低）；

注意需要同時設置多重對照（單獨注射病毒組、野生型注射組等）排除干擾。

文獻引用：

• Kim S, Kim YE, Song I, Ujihara Y, Kim N, Jiang YH, Yin HH, Lee TH, Kim IH. Neural circuit pathology driven by Shank3 mutation disrupts social behaviors. Cell Rep. 2022 Jun 7;39(10):110906. doi: 10.1016/j.celrep.2022.110906. PMID: 35675770; PMCID: PMC9210496.

• Bey AL, Wang X, Yan H, Kim N, Passman RL, Yang Y, Cao X, Towers AJ, Hulbert SW, Duffney LJ, et al. (2018). Brain region-specific disruption of Shank3 in mice reveals a dissociation for cortical and striatal circuits in autism-related behaviors. Transl. Psychiatry 8, 94. 10.1038/s41398-018-0142-6.

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