APPS | 用于農藥殘留檢測的表面增強拉曼光譜生物傳感器平臺：最新發展和未來展望

本文系Agricultural Products Processing and Storage原創編譯，歡迎分享，轉載請授權。

PART.1

Introduction

農藥的當前使用和危害狀況

由于世界人口的持續增長和食品供應鏈的全球化，對食品的需求不斷增加，這需要提高食品生產效率和食品安全。農藥在農業食品工業中發揮著非常重要的作用。農藥用于控制病蟲害，從而提高作物產量。因此，它們在確保全球糧食安全方面發揮著至關重要的作用。在過去的幾十年里，世界各地的農民在作物管理中使用了大量的農藥。《中國農業農藥卷》將農藥定義為用于控制有害生物（害蟲、螨蟲、線蟲、病原菌、雜草和嚙齒動物）和調節植物生長的化學品。該定義通常包括增強活性成分物理和化學性能的各種添加劑。1980年代之前，農藥的定義和范圍集中在有害物質的“殺滅”上。然而，目前更注重“調節”而不是“殺滅”，導致農藥被重新定義為“生物合理的農藥”、“理想的環境化合物”或“生物調節劑”。

根據其化學成分，農藥一般分為無機農藥和有機農藥。無機農藥通常含有硫和銅等元素，主要由天然礦物原料配制而成，也稱為礦物基農藥。有機農藥含有氟、氯、硫、磷、氧和碳元素。其中大部分可以通過有機化學合成方法生產。有機農劑在當前農藥市場中占據主導地位。

根據其化學結構，常見的有機農藥可分為有機磷（OPs）、有機氯、氨基甲酸酯、擬除蟲菊酯、有機氮化合物、雜環化合物和生物農藥。OPs通過磷酸鹽或硫代磷酸鹽結構發揮殺蟲、殺菌或除草作用，是目前使用最廣泛的農藥類別之一。有機氯農藥是一類含有氯原子的有機合成殺蟲劑。然而，由于其環境持久性和生物毒性，大多數品種已被禁止或嚴格限制其使用。大多數國家已限制或禁止使用高毒性氨基甲酸酯類農藥，但持久期較短的中毒性品種，如甲萘威，仍經常用于某些作物的害蟲防治和蚜蟲管理。擬除蟲菊酯類農藥和雜環農藥具有高效、低毒、起效快等特點，已廣泛應用于害蟲防治。生物農藥作為一種綠色環保的農藥，在有機農業中被廣泛用于綠色病蟲害防治。然而，與化學農藥相比，生物農藥穩定性差、起效速度慢，限制了其實用性和大規模應用。近年來，隨著精準農業的推廣和綠色發展理念的提出，農藥使用量最小化以及生物/化學防治相結合的應用越來越受歡迎。納米農藥技術也逐漸興起，推動農藥使用向高效、低毒、環保的轉變。

不可否認，農藥的大規模施用顯著提高了糧食產量，為緩解人口增長帶來的全球糧食危機做出了重要貢獻。然而，值得注意的是，隨著農藥的廣泛使用，包括許多情況下農藥的不當和過度使用，導致農產品中出現了大量的農藥殘留。研究人員證實，植物吸收的農藥會通過蒸發進入大氣，被云層攜帶，然后隨著降雨落回地面，形成包括土壤、空氣和水的污染循環。此外，農業用地的“徑流”會將農藥帶入水道，從而提供另一個污染源。許多化學農藥在環境中表現出顯著的持久性。即使經過很長一段時間，農藥或其衍生的降解產物仍然以殘留形式存在，并在食物鏈或生物鏈中積累。研究表明，許多農藥殘留具有細胞毒性和致癌性，或已被確定為各種健康問題的潛在危險因素。圖1顯示了過量農藥殘留對人體的直接或間接有害影響。因此，開發高效、精確的農藥殘留檢測技術對于最大限度地減少食品中的農藥殘留、提高整體食品質量和確保食品安全極為必要。

圖1 農藥殘留在土壤、水和空氣之間的遷移途徑及其對人類的直接和間接影響

常見農藥檢測技術

農藥殘留的檢測方法可分為兩類：第一類是傳統的分析方法，如高效液相色譜（HPLC）、氣相色譜（GC）、液相色譜-質譜（LC/MS）、酶聯免疫吸附測定（ELISA）;另一類是新興的檢測技術，如熒光法、酶抑制法和免疫層析試紙法。其中，色譜法具有靈敏度高、準確度好、多組分檢測、高通量檢測等優點。因此，它們適用于復雜樣品的分析。這些方法是目前農藥殘留檢測的權威方法。然而，色譜方法存在設備成本高、作復雜等缺點，限制了其在現場快速檢測場景中的廣泛應用。ELISA靈敏度高、成本低，適合大規模篩選，但也存在交叉反應率高、重復性差、無法提供結構信息等缺點。熒光方法具有速度等優點，但檢測范圍有限。此外，熒光信號穩定性通常較差，信號放大機制通常很復雜，導致定量準確性差。酶抑制方法具有成本低、適合現場檢測等優點，覆蓋OPs、氨基甲酸酯等主要農藥。然而，這些方法存在檢測范圍窄、易受矩陣干擾、靈敏度不足等缺點。免疫層析試紙具有速度快、可視檢測、穩定性好等優點，但只能檢測特定農藥或同類農藥。因此，傳統的農藥殘留檢測方法不適合滿足當前食品安全的要求。為了滿足田間農藥快速定性和定量分析日益增長的需求，有必要開發基于新型光學平臺的低成本快速檢測方法，用于農產品中農藥殘留的檢測。

表1 鑒定農藥的各種生物親和元素比較

表面增強拉曼光譜（SERS）技術與生物傳感的融合

SERS技術是一種使用等離子體納米結構進行信號放大的振動光譜技術，正在成為農藥殘留檢測的一種非常有效的工具。SERS具有分析時間快、無損、單分子級靈敏度、指紋識別和多殘留檢測能力等優點。SERS 涉及將可見光/近紅外激光聚焦到貴金屬或其他SERS活性基板上，以產生強烈的高度局部化電磁場。吸附在SERS襯底上的分子的拉曼信號被這些強場放大了許多數量級，從而產生了SERS光譜，提供了目標分子的指紋圖譜。因此，具有高增強因子的SERS襯底對于設計高靈敏度SERS傳感器至關重要。此外，與其最大的競爭對手熒光光譜相比，SERS具有許多優勢。這些優點包括：1）更好的光穩定性，不受光降解或光漂白的影響；2）更窄的光譜半寬，避免了不同物質之間的光譜峰重疊，提高了多殘留檢測能力；3）檢測更廣泛的分析物。原則上，任何具有拉曼活性的物質都可以增強拉曼信號。因此，SERS已成為一種有前途的技術，可用于各種應用，包括食品危害檢測、生物分析、臨床診斷和生物分子檢測。然而，只有當目標分子足夠靠近SERS底物表面時，才會發生SERS效應。同時，樣品基質中的組分可以通過非特異性吸附導致SERS底物失活。因此，限制非分析物分子進入SERS“熱點”（相隔幾納米的等離子體納米顆粒之間產生非常強烈的電磁場的區域）仍然是SERS技術發展中最大的挑戰之一。此外，一些農藥（如有機氯）與SERS底物的相互作用較弱，導致靈敏度低。因此，在滿足農藥殘留快速檢測需求的同時，增強SERS技術對農藥分子的親和力和選擇性至關重要。SERS的優缺點以及上述檢測方法在農藥殘留檢測中的優缺點如圖所示。

圖2 HPLC/GC、ELISA、LC/MS、酶抑制法、熒光傳感器、免疫層析試紙、拉曼光譜技術在農藥檢測中的優缺點

近年來，生物親和元素因其優異的選擇性、高特異性和強親和力而在分析檢測領域備受關注。將SERS與抗體、適配體和酶等生物親和元件相結合而開發的SERS生物傳感器，可以使SERS底物更具選擇性地捕獲不同的靶分子，從而實現準確的檢測（例如，更寬的分析范圍和更低的檢測限）。SERS生物傳感器已被證明可以快速檢測農產品中的農藥殘留，具有選擇性好、靈敏度高、檢測速度快、可靠性強等優點。這兩種技術的結合為農藥殘留的檢測提供了令人興奮的新機遇，并將更好地促進食品安全的發展。同時，近年來開發了許多市售的SERS底物。因此，SERS生物傳感器被認為是傳統分析方法快速檢測農產品中農藥殘留的一種有前途的替代方案，近年來在該領域發表了大量論文。盡管之前已經發表了幾篇關于SERS在農藥殘留檢測中的應用的綜述，但大多數都特別關注納米材料探針、碳納米材料、檢測策略等。據我們所知，用于檢測農產品中農藥殘留的SERS生物傳感器尚未得到系統審查，這激發了當前的工作。

本文從生物親和元素的分類和特性、功能納米材料的創新應用、傳感機制等方面全面概述了用于農藥殘留檢測的SERS生物傳感器（圖3）。更重要的是，我們還總結了現有用于農藥殘留檢測的SERS生物傳感器的優缺點，包括基于抗體的SERS免疫傳感器、SERS適體傳感器、酶輔助SERS生物傳感器和基于肽的SERS生物傳感器。我們還詳細討論了這些SERS生物傳感器的構造原理、檢測機制、設計策略和應用。本文還回顧和總結了該領域的最新趨勢、當前的挑戰，并提供了作者對未來前景的看法。我們希望本文綜述能為食品和農業領域對農藥殘留檢測、食品安全評估和風險緩解感興趣的研究人員提供有益的參考。

圖3 基于SERS生物傳感器的農藥殘留檢測主要原理和策略示意圖

PART.2

用于農藥檢測的功能性生物識別元件

生物親和元件作為特殊的目標識別元件，對于捕獲目標、提高SERS傳感器的選擇性和靈敏度至關重要。在不同類型的生物親和元素中，抗體、適配體、酶和肽是農藥識別最常用的生物親和元素。表1提供了這些生物親和元素的詳細比較。在以下部分中，將重點介紹各種類型的生物親和元素及其在實際樣品檢測應用中的進展。本文主要討論的生物親和元素包括抗體、適配體、酶和肽。

抗體

抗體是免疫系統產生的免疫球蛋白，可以與具有極高親和力和特異性的抗原結合。這導致了它們在生物傳感器領域的廣泛應用。根據重鏈的差異，它們可分為5大類：免疫球蛋白（Ig）A、IgD、IgE、IgG和IgM。具體而言，IgG是成熟免疫應答過程中產生的主要抗體，是構建生物傳感免疫文庫應用最廣泛的靶點。從分子結構來看，抗體由4條多肽鏈通過鏈間二硫鍵連接而成，形成特征性的“Y”形單體結構。該結構包含2個重要的功能區，其中片段結晶區（Fc區）負責效應器功能，而抗原結合片段（Fab區）介導特異性識別。在實驗室中，抗體是通過將靶分子注射到動物體內并收集其血液來獲得的。目前，研究人員經常將抗體與磁性納米顆粒（MNPs）和金納米顆粒（AuNPs）等功能材料偶聯，構建高性能的SERS生物傳感平臺，顯著提高了檢測的靈敏度和特異性。

然而，抗體對環境條件高度敏感，可以通過溫度波動、pH值變化和酶促降解而滅活。其次，由于抗體分子量大、制備成本高，抗體的位點特異性修飾具有挑戰性。此外，抗體需要嚴格的冷鏈儲存條件（通常在2～8 °C），這嚴重限制了其在現場檢測等非實驗室應用中的應用。從特異性的角度來看，多克隆抗體由于識別多個表位而容易發生交叉反應，而單克隆抗體雖然具有高度特異性，但顯著增加了制備成本。

為了克服這些限制，已經開發了用于農藥殘留檢測的納米抗體。納米抗體的分子量僅為15 ku，約為常規抗體分子量的1/10。此外，與傳統抗體相比，納米抗體具有更長的活性結合區，有16～18個氨基酸，具有更好的溫度穩定性和有機溶劑耐受性。其中一些納米抗體還可以耐受蛋白酶和更廣泛的酸和堿（傳統抗體只能耐受6～9的pH值，而納米抗體可以耐受2～11的pH值）。由于納米抗體具有易表達、穩定性高等優點，在SERS生物傳感器領域備受關注。

適配體

適配體通常是長度約為25～80個堿基的短單鏈寡核苷酸（DNA或RNA）序列，可通過配體指數富集系統進化的體外選擇過程獲得。由于其獨特的三維結構，適配體對多種靶標（包括農藥、病毒、蛋白質和其他分析物）具有高親和力和特異性。盡管適配體通常被視為“化學抗體”或“第四代抗體”，但其整體性能已明顯超過傳統抗體。適配體不僅具有更高的結合親和力和特異性，而且具有易于合成和修飾、批間差異小、理化穩定性、易于儲存、無毒、制造成本低等優點。

近年來，適配體已被用作傳統抗體的替代品，用于制造用于檢測各種農藥殘留的SERS生物傳感器。專門設計的農藥檢測適配體已被篩選并應用于光學和電化學分析與檢測領域。此外，作為單鏈寡核苷酸，它們可以與互補DNA（cDNA）雜交以構建具有競爭力的生物傳感器。此外，它們可能會在靶標存在的情況下發生顯著的構象變化，為新型和改進的生物傳感器的設計提供更大的靈活性和更強的選擇性。

酶作為具有高效催化功能的生物大分子（主要是蛋白質，還有一些催化活性核酶），在農藥殘留檢測方面具有許多優勢。農藥檢測常用的酶包括乙酰膽堿酯酶（AChE）、辣根過氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（ALP）。基于酶的生物傳感器的工作原理是酶抑制。通過分析催化反應的速率，這些傳感器可以量化農藥對酶活性的抑制作用，從而能夠測定農藥殘留濃度。這種檢測方法具有顯著的優勢，例如易于作、成本效益高以及適合大規模篩查。值得注意的是，有機磷和氨基甲酸酯類農藥的檢測靈敏度可達到十億分之一（ppb）水平。然而，這項技術仍然面臨挑戰，包括酶活性易受環境條件影響、對某些農藥類別的特異性不足以及來自復雜樣品基質的干擾。因此，目前的研究重點是酶固定化技術和納米材料修飾等策略，以提高檢測性能并促進實際應用。

在SERS生物傳感領域，酶的應用開辟了新的檢測途徑。一方面，酶催化反應產物（如TMB）產生的有色物質可用作SERS信號報告分子。報告分子的SERS信號可用作確定農藥殘留的代理。另一方面，農藥對酶活性的抑制會改變底物轉化效率，從而引起產品底物的SERS信號強度的變化（相對于無農藥下的酶）。通過將酶與金或銀（Ag）NPs等SERS活性底物結合使用，不僅檢測靈敏度顯著提高，而且檢測系統的穩定性也大大增強。近年來，具有模擬天然酶活性的納米酶的興起也為農藥殘留檢測提供了新的方法。同時，基于納米酶構建的生物傳感技術正逐步向“檢測-降解”一體化方向發展。這一技術演進路徑有效緩解了農藥殘留對食品安全和生態環境的危害。這種酶-SERS 組合生物傳感器技術為農藥殘留檢測提供了一種具有高靈敏度和特異性的創新解決方案。

肽是一種由氨基酸通過肽鍵連接形成的生物分子，在檢測農藥殘留方面表現出獨特的分子識別能力。與酶不同，肽主要通過其特定的氨基酸序列與農藥分子選擇性相互作用?；陔牡纳飩鞲衅鞯臋z測原理主要基于肽和農藥結合引起的構象變化，可以通過熒光標記、電化學信號或SERS強度等技術將其轉化為可檢測的信號。多肽生物傳感器的優點包括分子量小、易于化學合成和修飾、穩定性好，以及能夠通過噬菌體展示等技術有效地篩選特定農藥的識別肽片段。通過將多肽固定在生物傳感器上，可以增強傳感器的親和力并提高其特異性。然而，肽也有缺點，例如與抗體相比親和力低，容易被蛋白酶降解。近年來，多肽與金屬納米顆粒、響應性聚合物等功能組分的共組裝技術得到了發展。通過共價鍵、超分子相互作用或靜電吸附等界面調控，構建了具有協同效應的復合體系，進一步拓寬了多肽在傳感器技術中的應用。

在SERS生物傳感領域，多肽多用作分子捕獲探針，將農藥分子固定在SERS活性底物表面。此外，金屬納米顆粒的聚集狀態可以通過肽調節以產生等離子體偶聯效應（即產生SERS）。通過合理設計肽序列和優化SERS底物，可以實現對各種農藥的高靈敏度檢測。

PART.3

SERS生物傳感器在農藥快速檢測中的應用

基于生物親和元件和SERS技術的結合，開發了更廣泛的SERS生物傳感器，從而融合了選擇性識別和高靈敏度的優點。上一節中已經描述了農藥檢測常用的生物親和元素。近年來，許多SERS生物傳感器被設計和開發用于檢測農藥殘留。本文綜述了SERS生物傳感器在農藥殘留快速檢測中的應用和分類。表2列出了SERS生物傳感器在農藥檢測中的一些代表性應用。

表2 農藥殘留檢測用不同SERS生物傳感器的檢測限和線性檢測范圍匯總

SERS免疫傳感器的應用

免疫傳感器是一種基于特異性抗原抗體識別原理的先進生物傳感平臺。它們具有特異性強、檢測效率高的特點。這些免疫傳感器將免疫反應與適當的傳感器相結合，通過將免疫反應信號轉換為可量化的光學信號來檢測目標分析物。與傳統的免疫測定技術相比，免疫傳感器在定量分析的快速性、靈敏度和特異性方面表現出優異的性能?？贵w對農藥抗原的特異性和敏感性是構建有效免疫傳感器的關鍵。通常，抗原是指能夠誘導免疫反應的分子，而與抗體結合但缺乏免疫原性的分子稱為“半抗原”。農藥分子是半抗原的典型例子，只有在與牛血清白蛋白（BSA）等大生物分子偶聯時才能獲得完全抗原性。近年來，SERS免疫傳感器在農藥檢測中的應用得到了廣泛的研究和發展。

根據檢測方法的不同，用于農藥殘留檢測的抗體修飾SERS免疫傳感器可分為無標記和標記的SERS免疫傳感器。無標記免疫傳感器通過測量抗原-抗體復合物形成后的信號變化來定量靶標，包括農藥拉曼指紋信號或導致拉曼信號變化的抗體構象變化。相比之下，標記的SERS免疫傳感器通過拉曼報告分子的信號變化間接實現靶點檢測，從而實現更靈敏和通用的檢測。近年來，農藥殘留的SERS免疫測定主要集中在標記免疫傳感器上。為了實現農藥殘留的痕量檢測，開發了一系列高性能的SERS底物來增強檢測能力。其中，Au和Ag NPs因其顯著的增強效果、易于制備的工藝、與生物分子的優異生物相容性以及通過多種類型或尺寸提高靈敏度的能力而被廣泛用作SERS免疫探針的底物。同時，免疫層析分析（ICA）具有成本低、作簡單、速度快等優點，但存在靈敏度低、定量分析有限等缺點。兩種技術的結合充分利用了各自的優勢，為農藥殘留篩查提供了創新的解決方案。

此外，為了實現多種農藥殘留的同時SERS檢測，開發了基于LFIA-SERS技術的多殘留檢測試紙。例如，馬等提出了一種便攜式SERS雙通道條帶雙模態免疫測定法，用于同時檢測混合農藥殘留。首先，通過肉眼觀察可以實現半定量估計。其次，便攜式拉曼光譜儀可用于提取光譜數據，進行精確定量檢測。以4-巰基苯甲酸（4-MBA）偶聯抗體標記的核殼雙金屬材料Au@Ag作為信號探針，提供穩定的拉曼信號。同時，通過靜電吸附將Au NPs與兔IgG連接起來，作為指示探針，以確保試紙的正常運行。在這個平臺上，每種農藥都與固定在測試線上的包被抗原（T線）競爭性結合。當農藥占據信號探針的結合位點時，BSA包被的抗原捕獲過量的信號探針。通過特異性免疫應答，檢測線上包被抗原捕獲的免疫探針數量與目標農藥分子數量呈負相關。通過采集2個T線SERS信號，實現了2種農藥的同時檢測。利用抗原和抗體之間的免疫特異性結合，將抗原偶聯的SERS納米探針固定在試紙的3條T線上，以放大拉曼信號。以4-MBA封裝的Au@Ag NPs作為SERS讀數源，評估了不同濃度下SERS探針的增強和穩定性。隨后，將SERS納米標簽與不同的抗體結合，對分析物進行快速、超靈敏的SERS檢測。當存在一個或多個靶標時，通過與相應的 SERS 探針結合來特異性識別特定靶標。然后，這些探針與T線上相應的BSA或卵清蛋白偶聯抗原競爭。使用三重試紙，根據試導線區域的顏色變化，在8分鐘內目視檢測IMI、PYR和AFB1。通過測量T線上的SERS信號強度進行準確的定量分析。IMI、PYR和AFB1的LOD分別為8.6、97.4和8.9 pg/mL。雖然LFIA-SERS檢測農藥殘留結合了免疫識別的特異性和SERS的高靈敏度，但仍存在以下缺點。首先，在ICA系統中，用納米顆粒標記的抗體在色譜過程中可能會發生非特異性吸附，影響檢測特異性。其次，樣品基質中的復雜成分（如蛋白質和色素等）容易干擾SERS信號。最后，由于存在交叉干擾，該方法對多種農藥殘留的同步檢測能力仍然有限。

此外，傳統的拉曼報告分子通常在指紋區域達到峰值，并且在現場快速測試時容易受到樣品基質的干擾。為了獲得更好的抗干擾能力，研究人員采用“生物沉默”區域的無干擾拉曼報告分子作為SERS信號源。利用多色SERS納米標簽實現了在LFIA中同時檢測單條T線內的多個目標，顯著提高了檢測效率、可靠性和應用靈活性（圖1）。本研究開發了兩種類型的納米探針，可以編碼顏色和拉曼信息，以解決SERS-LFIA中同時多路檢測單條T線的挑戰。同時，納米探針分別編碼為可區分的藍色和紅色，從而能夠在多個LFIA中進行比色研究以進行定性分析。此外，它們在拉曼“生物靜音”區域編碼獨特且不重疊的拉曼信號，通過有效避免樣品基質中的相互干擾和背景信號來確保準確和靈敏的檢測。多菌靈（CBZ）和IMI的LOD分別為0.03和0.04 ng/mL。一種具有光學抗干擾能力的腈介導免疫傳感器，用于靈敏檢測IMI。將抗IMI抗體偶聯到Fe3O4表面磁性NP作為捕獲探針（Fe3O4-抗體）。將4-MBN和BSA-IMI抗原偶聯在Au@Ag納米立方體表面作為信號探針（抗原-Au@Ag-4-MBN）。通過抗體和抗原之間的特異性識別，在2個探針之間形成復合物。由于IMI與抗原-抗體的競爭性結合，信號探針與捕獲探針的表面分離。4-MBN的SERS強度隨著IMI的加入而降低，在10～400 nmol/L濃度范圍內呈線性關系。結果表明，該方法能夠有效提高光學抗干擾能力，消除干擾有機污染物與4-MBN之間可能存在的光譜疊加。此外，Fe3O4磁性NPs可以簡化分離過程，并顯著提高信號探頭中4-MBN的SERS強度。利用“生物沉默”區拉曼報告分子有效避免了農藥殘留快速檢測中的干擾基質，大大提高了SERS免疫傳感器方法的準確性。

圖4 （A）基于設計的納米探針的LFIA示意圖；（B）基于拉曼沉默光譜窗口標記分子同時檢測ACE和CBZ混合農藥的示意圖

SERS aptasensors的應用

適配體能夠通過堿基配對、氫鍵、范德華力、疏水相互作用等鏈內力形成具有獨特構象的三維結構，從而能夠特異性地與目標分子結合。適配體作為一種新的識別元件，為構建具有高靈敏度和特異性的傳感平臺提供了創新的解決方案，顯著提高了農藥殘留檢測的準確性和效率，為食品安全監測開辟了新的途徑。適配體傳感器憑借優異的選擇性和超高靈敏度，已成為農產品農藥殘留檢測領域的核心技術工具。近年來，SERS適配體傳感器備受關注，在農藥殘留檢測方面表現出優異的性能。

根據其檢測機制，常見的SERS適配傳感器可分為“夾層型”和競爭型適配傳感器。其中，“夾層式”傳感器采用雙適配體夾層結構，通過捕獲探針和信號探針的雙重識別實現對目標分子的檢測。相反，競爭性適配傳感器基于靶分子與互補DNA（c-DNA）之間有限適配體結合位點的競爭機制實現定量分析。一種SERS適配傳感器，使用PB包覆的金NPs（Au@PB NPs）作為SERS信號探頭，用于非干擾定量農產品和河流中的毒死蜱（CPF）殘留物（圖1）。將CPF適配體組裝在Au@PB NP上作為SERS探針（Au@PB NPs@Apt）。同時，制備結合c-DNA的MNPs作為捕獲探針。在CPF存在下，CPF和適配體之間的特異性相互作用抑制Au@PB NPs@Apt和MNPs@c-DNA的結合。結果表明，Au@PB NPs的拉曼強度與CPF濃度成反比。在最佳條件下，該SERS適配傳感器對CPF的檢測顯示出0.1～316.0 ng/mL范圍內的線性響應，LOD為0.066 ng/mL。此外，制備的傳感器在測定黃瓜、梨和河水樣品中CPF方面顯示出良好的應用潛力。

圖5 （A）無干擾適配傳感器和CPF檢測的制造過程示意圖；（B）SERS適配傳感器的構造和工作原理示意圖

盡管基于SERS適配傳感器的快速檢測方法存在穩定性差、準確率低等局限性，但它們仍然是農藥殘留快速檢測的主流方法。研究人員現在正試圖通過各種方法優化和改進SERS適配傳感器技術，以提高傳感性能，主要重點是開發基于陣列的基板。一種基于襯底的柔性陣列型SERS傳感器，用于無干擾、靈敏地檢測蘋果中的CBZ（圖5B）。通過液-液自組裝策略將金nanostars@Ag（AuNS@Ag）沉積在靜電紡絲PVDF/CQDs薄膜上，形成柔性SERS襯底。引入4-（巰基甲基）苯并腈（MMBN）作為拉曼報告分子，在“生物沉默”區域的2227 cm?1處提供明顯的拉曼峰，從而提供無干擾素的SERS信號。將所得薄膜與CBZ適配體結合作為捕獲底物，而與CBZ適配體和MMBN連接的Au NPs作為SERS信號探針。在CBZ存在的情況下，兩種適配體和CBZ之間的特異性相互作用促進了捕獲底物和SERS信號探針的結合，從而產生了可測量的SERS信號響應。

此外，還開發了用于檢測多種殘留農藥的SERS apatasensors。例如，將3個拉曼報告分子偶聯到Au NPs表面，并與特定適配體進一步功能化，作為SERS信號探針，包括2-氨基-4-氰基吡啶、4-乙基苯胺和PB。同時，MNPs與c-DNA偶聯作為捕獲探針。添加農藥分子后，由于農藥分子與c-DNA之間的競爭性識別，磁分離后SERS信號探針的拉曼強度降低。同時，研究人員將多個無干擾的“生物靜音”區SERS信號探針與磁分離技術相結合，實現了對各種農藥殘留的無干擾檢測。例如，分別將MMBN和PB分子修飾到Au和Ag NPs的核殼間隙中，然后偶聯2個c-DNA，成功合成了2個SERS信號探針。同時，適配體修飾的Fe3O4@Au MNP用作捕獲探針。實驗結果表明，2077和2228 cm?1處的拉曼信號強度分別與啶蟲脒（ACE）和CBZ濃度呈負相關。在優化條件下，構建的SERS適配傳感器在0.01～1.00 mg/kg范圍內檢測ACE和CBZ的線性范圍很廣，LOD分別為9.43和9.17 μg/kg。我們的研究團隊開發了一系列“生物沉默區”DNA自組裝SERS適配傳感器，用于檢測食品中的多種有毒有害物質。同時，我們團隊首次模擬并篩選了氰基可編程分子庫，在一定程度上改善了“生物沉默區”拉曼報告分子的短缺，為抗干擾SERS生物傳感提供了新思路?？傮w而言，SERS 適配傳感器方法在農藥殘留檢測領域有著廣泛的應用，但也存在一些局限性。該方法的主要局限性涉及復雜的樣品基質，這會導致適配體的構象變化或活性損失，從而顯著影響測試結果的準確性和可靠性（尤其是食品測試）。此外，該方法還面臨適配體合成成本高、批間重現性差、信號穩定性低等技術瓶頸，亟待解決。

基于酶的SERS生物傳感器的應用

基于酶的SERS生物傳感器代表了一種新型的農藥殘留檢測技術。它們通過將酶抑制原理與SERS信號放大技術相結合，實現了高靈敏度的檢測。該技術的原理是利用農藥分子對特定酶活性的抑制作用。當酶催化底物生成SERS活性產物的過程受到農藥抑制時，特征SERS信號的強度降低，從而實現農藥殘留的定量分析?；诿傅腟ERS生物傳感器雖然具有作簡單、成本低等優點，但也存在明顯的局限性。首先，酶抑制法使得區分特定類型的農藥變得困難。其次，農產品或食品基質中的天然成分可能會干擾酶活性，導致假陽性或假陰性結果。

為了提高基于酶的傳感檢測方法的準確性，研究人員將化學計量方法與SERS技術相結合。例如，El Alami等建立了基于AChE活性測定的農藥雙模式檢測平臺。一方面，通過SERS技術高靈敏度監測AChE酶活性的變化。另一方面，直接獲得農藥分子的特征指紋譜圖用于類型鑒定。采用該策略，以AuNPs為SERS活性底物，成功檢測了對氧核和甲萘威。對氧酮的LOD分別為4.0×10?14 mol/L，甲萘威的LOD分別為1.9×10?9 mol/L。值得注意的是，基于酶抑制原理的間接檢測方法比直接SERS分析表現出更高的靈敏度（2～3個數量級），這主要歸因于酶催化反應的信號放大效應。這一發現為農藥殘留的SERS檢測提供了新的工具箱。此外，一種基于Ag@Au雙金屬NPs的SERS生物傳感器，用于靈敏檢測食品中的農藥殘留（圖6）。該傳感器利用4-巰基苯基硼酸（4-MPBA）修飾的Ag@Au雙金屬NPs作為SERS探頭。AChE與膽堿氧化酶的結合可水解乙酰膽堿產生H2O2。然后，H2O2選擇性地氧化4-MPBA的硼酸酯基團，由于對稱B-O拉伸而降低拉曼信號。在存在抑制H2O2產生OP的情況下通過破壞AChE的活性，降低了SERS信號的衰減。該生物傳感器無需任何復雜的樣品預處理。以對硫磷甲基為OPs的代表模型，該方法的線性范圍為5.0×10?9～5.0×10?4 mol/L，LOD為1.7×10?9 mol/L。然而，傳統的酶生物傳感器在實際應用中仍面臨天然酶成本高、穩定性差、環境（如溫度和pH值變化）受限等瓶頸。

圖6 （A）基于Ag/Au雙金屬納米顆粒的乙酰膽堿酯酶SERS生物傳感器的示意圖，用于原位靈敏檢測食品中有機磷農藥殘留；（B）雙功能TN@Ti-MOFs/PT納米探針催化納米金反應-SERS/RRS雙模式測定吡蟲啉

近年來，納米酶的引入為基于酶的SERS生物傳感器的發展帶來了革命性的變化。納米酶是尺寸在1～100 nm范圍內的納米材料，具有類似酶的催化特性。與天然酶相比，納米酶具有優異的生物相容性、低成本、靈活的設計和高穩定性等優點，使其在各個領域得到了廣泛的發展和應用?；诩{米酶的SERS系統在分析檢測中具有廣闊的應用前景。一方面，納米酶不僅具有酶模擬活性，而且還可以作為SERS底物發揮雙重作用。另一方面，納米酶與SERS-活性材料的整合導致了多功能納米酶-SERS系統的形成。馬等建立了水中草甘膦（Gly）的間接SERS檢測方法。檢測機制涉及Cu2+與L-半胱氨酸（L-cys）的結合，以減輕L-cys對Au-Pt納米酶的抑制作用。同時，成功制備了一種具有良好重復性的新型Au-Ag納米鏈復合材料，用于檢測氧化3,3',5,5'-四甲基聯苯胺（oxTMB）的SERS信號，而不會干擾TMB的拉曼信號。oxTMB在1605 cm?1時的SERS信號強度與Gly濃度成正比。在優化條件下，在10～1000 mg/L的濃度范圍內獲得了良好的線性響應。Gly檢測的LOD為5.0 μg/L，定量限為10 μg/L。

此外，為了進一步增強基于酶的檢測方法的實用性和便攜性，研究人員創新性地將納米酶SERS傳感器與比色分析方法相結合，構建了雙模檢測平臺。這些集成傳感系統利用檢測模式的互補性。通過用肉眼觀察顏色變化（如藍色TMB2+的產生）來實現現場半定量解釋，并借助手持式拉曼光譜儀同時進行精確的定量分析。一種基于分子印跡聚合物（MIP）和納米酶標記技術的仿生納米酶聯免疫吸附測定（BNLISA）檢測方法。Pt NPs作為有效的過氧化物酶模擬物，特異性催化無色TMB的氧化，生成藍色TMB2+，可作為優良的SERS信號報告分子。在檢測模式下，TMB2+和BSA-半抗蛋白復合物對MIP結合位點的競爭顯著提高了檢測的選擇性。BNLISA方法成功實現了三唑磷的雙模式檢測（通過比色法和SERS法），LOD為1.0 ng/mL，為農藥殘留分析提供了一種新方法。

基于多肽的SERS生物傳感器的應用

近年來，基于SERS技術的多肽功能化納米探針在農藥殘留檢測領域引起了人們的關注。這些探針結合了肽分子的高特異性識別能力和SERS技術的高靈敏度優勢，為痕量農藥檢測提供了創新的解決方案。多肽功能化納米探針的設計通常使用等離子體金屬納米材料（如Au或Ag NPs）作為SERS增強底物，通過物理吸附或化學偶聯將特定的識別肽負載在Au或Ag NPs表面。肽鏈的氨基酸序列可以通過定向進化或分子對接技術進行優化，形成目標農藥分子的高親和力結合位點（利用氫鍵或疏水相互作用），從而實現選擇性捕獲。SERS信號的產生依賴于金屬納米結構的局部表面等離子體共振效應，肽的修飾不僅增強了探針的靶向性，而且通過調節納米顆粒的聚集態或表面電荷進一步優化了信號強度。一種簡單、快速、高靈敏度的雙模式農藥殘留檢測方法（圖6）首先，通過在MXene Ti上負載鈦基有機骨架（Ti-MoFs）和IMI特異性多肽鏈（PTIMI），合成了一種新型雙功能納米探針（TN@Ti-MOFs/PT）3C2Tx納米片。研究發現，TN@Ti-MOFs/PT不僅特異性識別IMI，而且在80 ℃下催化Au NPs的生成。生成的金粒子可用作370 nm處諧振瑞利散射（RRS）的光學探針。當目標分子IMI存在時，它與PTIMI的特定堿基序列相互作用，導致PT鏈從TN@Ti-MOFs/PT納米探針表面分離，暴露出豐富的氧化還原位點，加速氧化還原電荷轉移，導致AuNPs產生增加和SERS/RRS信號增強?；谠摲椒?，開發了一種高靈敏度和特異性的基于PT的雙模生物傳感平臺，用于檢測痕量IMI，線性范圍為0.01～0.25 ng/mL。SERS和RRS方法的LOD分別為0.0011和0.0039 ng/mL。

同時，最近的研究報告表明，存在于噬菌體M13表面的色氨酸-組氨酸-色氨酸（WHW）肽序列是與百草枯（PQ）特異性結合的分子識別單元。利用噬菌體展示技術對表面顯示肽進行高效篩選和功能修飾，結合SERS技術構建信號檢測平臺，實現PQ的高度靈敏度識別和定量分析。Koh等構建了一種用于選擇性農藥檢測的M13噬菌體功能化SERS傳感器。將基因工程M13噬菌體裝飾在銀納米線（Ag NWs）表面，在玻璃纖維濾紙上形成Ag NWs的網絡結構。Ag NWs的隨機堆疊產生高密度的SERS“熱點”和顯著增強的拉曼信號。此外，表達色氨酸-組氨酸-色氨酸肽序列的表面功能化M13噬菌體可用作生物受體，選擇性檢測PQ。在PQ預處理的蘋果皮表面檢測到PQ，結果證明了紙基SERS基質在田間殘留農藥檢測的可行性。

PART.4

Conclusion and perspective

農藥殘留帶來的重大危害引起了各個領域的關注，推動了新型高效檢測技術的發展。在過去十年中，已經發表了許多與快速檢測農藥殘留相關的研究，以滿足食品安全和檢測控制的需求。在前面的章節中，我們討論了最近報道的一系列基于SERS的生物傳感器系統，用于農藥殘留檢測。SERS技術在農藥殘留分析中發揮著重要作用。特別是，生物識別元件的進步為改進SERS檢測技術創造了新的機會，克服了直接SERS檢測方法的許多局限性。許多報告強調了SERS生物傳感器方法在實現農藥殘留的高靈敏度、選擇性、快速和經濟高效的檢測方面的優勢。本文綜述了不同食品和農產品中農藥殘留檢測的現狀。隨后，討論了抗體、適配體、酶和肽在農藥殘留檢測中的應用，重點關注了用于農藥檢測的SERS生物傳感器。SERS生物傳感器具有高靈敏度、便攜性、易于作和良好的選擇性，在檢測各種基質中的農藥方面表現出優異的性能。然而，在將這些SERS生物傳感器應用于農藥殘留的實際檢測時，會出現某些局限性。

1）經過多年的改進和發展，LFIA現已為農藥殘留檢測提供了一個靈敏、簡單、直觀的技術平臺，部分農藥檢測系統已實現商業化。然而，它仍然面臨一些挑戰。LFIA依賴于抗原和抗體之間的特異性相互作用。如果抗體對靶分子的識別能力不足，則可能與結構類似物發生交叉反應，導致假陽性結果。近年來，大多數LFIA技術都使用單克隆抗體來特異性識別靶分析物。然而，單克隆抗體的制備過程耗時、成本極高，且批次之間存在顯著差異。同時，某些農藥的抗體通常無法上市，新的農藥特異性抗體的開發是一個高度復雜的過程。納米標記材料的試紙在制備過程中面臨著材料合成步驟復雜的問題，這可能受到納米材料穩定性差的影響。此外，當用于同時檢測多種目標物質時，不同顏色之間的顏色變化可能會影響結果判斷，相互干擾也會降低檢測靈敏度，這對LFIA傳感器的商業化提出了重大挑戰。未來，應開發特異性識別探針來替代單克隆抗體，如全長重組抗體、適配體、噬菌體及其裂解物。此外，開發穩定和優良的紙基材料仍然是未來的主要目標，同時開發更高度特異性的探針技術。

2）近年來，納米抗體與熒光傳感技術廣泛結合，建立了競爭性的熒光免疫測定方法等，以實現農藥的高效檢測。此外，針對現場檢測應用的需求，還開發了基于納米抗體的LIFA檢測技術。然而，據我們所知，迄今為止還沒有關于納米抗體和SERS聯合用于農藥殘留檢測的報道。因此，未來應進一步開發基于納米抗體的SERS生物傳感器，以增強農藥殘留檢測能力。

3）作為一種先進的分析工具，SERS適配體傳感器與其他生物傳感器相比顯示出顯著的優勢。適配體的合成過程相對簡單，價格低于抗體，并且表現出更高的穩定性。同時，適配體可以通過修飾官能團靈活標記各種SERS探針，大大豐富了檢測。然而，目前的SERS適配體傳感技術仍面臨挑戰。適配體對小分子農藥的親和力和特異性有限，容易與結構類似物發生交叉反應。同時，現有農藥適配體數量較少。目前的SERS適配體傳感檢測往往依賴于磁分離技術，影響信號的重復性和穩定性。同時，SERS適配體傳感器容易受到樣品基質、離子強度和pH等環境因素的影響，這限制了其大規?，F場檢測應用。檢測系統中適配體和納米顆粒的偶聯可能會改變適配體的構象并影響結合效率，而多種農藥殘留的檢測能力有限。因此，應篩選更多的農藥適配體，以找到更多的農藥適配體。持續開發用于農藥殘留檢測的便攜式、智能和直觀的SERS適配體傳感器是當務之急。近年來，SERS-比色雙模傳感器以及適配體基紙基側相色譜雙模SERS傳感器在危害的感知和檢測中顯示出巨大的應用前景，將成為農藥殘留快速檢測的有力工具。同時，為了應對復雜基質成分帶來的SERS適配體傳感挑戰，開發快速高效的樣品預處理技術尤為重要。

4）酶催化反應的信號放大效應可以顯著提高檢測靈敏度。此外，農藥對酶具有廣譜抑制作用，無需為每種農藥開發特定的識別元件，從而有效降低檢測成本和技術壁壘?；诿敢种频目焖贆z測已成為一項成熟且商業化的技術。然而，目前基于酶的SERS生物傳感器仍存在特異性不足、靈敏度差、定量分析困難、容易產生假陽性結果等問題。他們對實驗條件也有嚴格的要求。因此，需要引入適配體、抗體或MIP等特異性識別元件，結合酶抑制系統，實現“酶催化—分子識別”的雙重作用機制，從而提高檢測特異性。此外，應進一步發展仿生酶催化系統，以放寬實驗條件限制，推動基于酶的SERS生物傳感器不斷向高特異性、高靈敏度和易作方向發展。

5）多肽具有制備成本低、結構修飾靈活、體積小等優點。它們可以通過化學合成快速獲得，方便地與納米顆粒偶聯，并且還可以使用成熟的篩選技術獲得高親和力序列。然而，基于肽的SERS生物傳感器存在明顯的缺陷。由于多肽對農藥的親和力相對較低，難以滿足痕量檢測的要求。此外，它們容易被蛋白酶降解，導致穩定性受損。雖然農藥在復雜基質中容易發生非特異性吸附，但基于肽的SERS生物傳感器的整體性能仍遠低于基于抗體或適配體的SERS生物傳感器。因此，近年來，基于肽的SERS生物傳感器受到的關注較少。

6）在實際檢測中，當基質中的干擾物質進入SERS“熱點”時，會干擾目標分子的拉曼信號，導致檢測精度和重現性差。同時，熒光團通常在可見光區域（＜1800 cm?1）產生強背景，直接掩蓋拉曼信號。“生物靜音區”是背景干擾低、幾乎沒有生物背景噪聲的光譜區。高信噪比拉曼峰顯著提高了檢測的抗干擾能力和靈敏度，特別適用于復雜生物系統中的痕量分析?；凇吧镬o音”區域的SERS生物傳感平臺引起了人們的廣泛關注，越來越多地用于食品中威脅的現場SERS快速檢測。近年來，“生物靜音”區SERS生物傳感器在人類疾病標志物、食品檢測等領域得到了廣泛的應用。然而，它們在農藥殘留檢測領域的開發和應用仍處于起步階段，代表著未來的機遇。

7）盡管SERS生物傳感器的開發和應用受到了廣泛關注，但推動該技術的實際應用仍存在挑戰。首先，為了促進此類生物傳感器的規?；a和應用，需要進一步整合機器學習、化學計量學等輔助分析方法，開發比色法等形式的便攜式檢測系統，以解決方法的成本和不便問題。其次，需要開發SERS生物傳感器在植物表面或內部的現場檢測應用。一種可能的解決方案可能是開發水凝膠微針SERS生物傳感貼片。第三，仍需深入研究以增強SERS生物傳感器的穩定性和耐久性。例如，可以采用表面化學改性來減輕其對環境的敏感性。一般來說，研究人員未來應該更多地關注SERS生物傳感器在生產中的實際應用。

Surface-enhanced Raman spectroscopy biosensor platforms for pesticide residue detection: state-of-the-art developments and future outlook

Chen Chen1, Ximo Wang1, Dongxiao Sun?Waterhouse1,2, Geoffrey I. N. Waterhouse2*, Zhixiang Xu1*

1 College of Food Science and Engineering, Shandong Agricultural University, Tai’an, 271018, China

2 School of Chemical Sciences, The University of Auckland, Auckland, 1142, New Zealand

*Corresponding author.

Abstract

In the agricultural sector, pesticides are widely used to enhance crop yields and protect plants from pests and diseases. However, pesticide residues pose significant threats to humans, animals, insects and ecosystems. Accordingly, the rapid, sensitive, and accurate detection of pesticide residues is of great significance for protecting human health and the wider environment. Surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) is increasingly being applied for the detection of hazardous substances in foods. Furthermore, biological recognition elements (such as antibodies, aptamers, etc.) are widely applied in food safety assessment due to their high specificity and low cost. Combining bio-affinity elements with SERS technology can create efficient and accurate pesticide residue detection platforms. This review summarizes recent progress in the development of SERS biosensors for the detection of pesticide residues. Strategies for integrating specific recognition elements (especially antibodies and aptamers) with the plasmonic SERS nanosystems are discussed. Then, selected case studies are introduced highlighting the advantages of such SERS biosensors for pesticide detection, before future prospects of this research field are discussed. This review guides the development novel SERS biosensors for pesticides and other target analytes.

Reference:

Chen, C., Wang, X., Sun-Waterhouse, D. et al. Surface-enhanced Raman spectroscopy biosensor platforms for pesticide residue detection: state-of-the-art developments and future outlook. Agric. Prod. Process. Sto. 1, 27 (2025). https://doi.org/10.1007/s44462-025-00031-7

翻譯：田雨欣（實習）

編輯：梁安琪；責任編輯：孫勇

封面圖片來源：攝圖網

APPS感謝您的關注

歡迎廣大作者積極撰寫論文，踴躍投稿！

（點擊左側二維碼查看期刊主頁）