J VIROL|哈爾濱醫(yī)科大學(xué)趙文然/鐘照華教授團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)B組柯薩奇病毒3D聚合酶的擬素化修飾可促進(jìn)病毒復(fù)制

B組 柯薩奇 病毒（ Coxsackievirus group B，CVB ）是一類無包膜的單股正鏈RNA病毒，屬于小RNA病毒科腸道病毒屬。目前已知的CVB有六種血清型（CVB1~6），其引發(fā)的疾病譜系從普通感冒到病毒性心肌炎、胰腺炎及腦膜炎不等。其中，CVB1、CVB3和CVB5具有天然嗜心臟特性，而CVB3 已被證實(shí)是心肌炎、擴(kuò)張型心肌病甚至心力衰竭的主要致病病原體 ，目前仍缺乏特異有效的抗病毒藥物。

近日，哈爾濱醫(yī)科大學(xué)趙文然教授聯(lián)合鐘照華教授團(tuán)隊(duì)在Journal of Virology上發(fā)表了題為“The neddylation of the RNA-dependent RNA polymerase 3D of Coxsackievirus B3 promotes viral replication”的研究論文，系統(tǒng)的揭示了 擬素化（ neddylation ）修飾在促進(jìn)CVB3復(fù)制過程中的關(guān)鍵作用和分子機(jī)制。

作者首先通過質(zhì)譜分析技術(shù)對CVB3感染細(xì)胞的蛋白表達(dá)譜進(jìn)行解析，發(fā)現(xiàn)病毒感染后NEDD8的表達(dá)顯著上調(diào)。隨后，為探究單個病毒蛋白是否具有影響擬素化修飾的能力，作者對表達(dá)病毒成熟蛋白或前體蛋白細(xì)胞中NEDD8的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示所有病毒蛋白均未能改變NEDD8表達(dá)水平，提示NEDD8上調(diào)及擬素化修飾增強(qiáng)是病毒復(fù)制所導(dǎo)致的。作者通過CVB5感染實(shí)驗(yàn)證實(shí)，擬素化修飾上調(diào)現(xiàn)象在不同CVB血清型中具有普遍性，這暗示了擬素化修飾上調(diào)在CVB感染過程中具有重要意義。由于前期研究發(fā)現(xiàn)3D聚合酶存在泛素化修飾，而泛素與NEDD8蛋白具有高度同源性，作者因此推測3D可能發(fā)生擬素化修飾。為驗(yàn)證該假設(shè)，作者進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)在發(fā)生翻譯后擬素化修飾的是3D而非3C或其前體蛋白。時間梯度實(shí)驗(yàn)顯示，隨著病毒感染進(jìn)程，高分子量的3D會發(fā)生持續(xù)性累積。此外，為了明確3D是否受NEDD8修飾，作者分別對過表達(dá)3D的細(xì)胞進(jìn)行了變性免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，外源表達(dá)的3D確實(shí)發(fā)生擬素化修飾。隨后，作者在病毒感染自然進(jìn)程中也確認(rèn)了3D的擬素化修飾現(xiàn)象。以上結(jié)果充分的證明了CVB3的3D蛋白發(fā)生擬素化修飾。

接下來，作者發(fā)現(xiàn)敲低NEDD8導(dǎo)致病毒RNA水平顯著下降，表明擬素化修飾能有效促進(jìn)CVB3復(fù)制，點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示3D的擬素化修飾特異性發(fā)生于第261位和第457位賴氨酸殘基。隨后，作者通過放線菌酮追蹤實(shí)驗(yàn)檢測野生型3D及其K261、K457及K261/457位點(diǎn)突變體的降解速率，結(jié)果顯示過表達(dá)NEDD8可顯著抑制3D降解，這表明擬素化修飾能有效增強(qiáng)3D穩(wěn)定性。相反，在K261、K457或雙位點(diǎn)突變體（K261/457）中，3D降解速率均顯著加快，這充分證明了擬素化修飾有助于提高3D的穩(wěn)定性。

最后，作者對CVB3如何利用擬素化修飾來增強(qiáng)3D的穩(wěn)定性進(jìn)行了深入探究。作者通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)對與3D相互作用的蛋白進(jìn)行檢測。由于 已知的NEDD8 E3連接酶均屬于泛素E3連接酶家族 ，因此作者特別關(guān)注泛素E3連接酶。有趣的是，質(zhì)譜檢測的結(jié)果顯示TRIM4與3D蛋白存在相互作用。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，作者進(jìn)一步證實(shí)了TRIM4不僅能與3D相互作用，還能以劑量依賴方式增強(qiáng)3D的擬素化修飾。此外，敲低TRIM4幾乎完全阻斷了3D的擬素化修飾，而過表達(dá)TRIM4有效的促進(jìn)病毒蛋白3D和VP1蛋白的表達(dá)水平。更明顯的是，在過表達(dá)TRIM4的細(xì)胞中還觀察到CVB3的復(fù)制呈顯著提升。以上數(shù)據(jù)共同證明，TRIM4通過介導(dǎo)3D的擬素化修飾來促進(jìn)CVB3復(fù)制。

綜上所述，本研究證實(shí) NEDD8 在CVB3的3D蛋白的第261位和第457位賴氨酸殘基處發(fā)生修飾，有助于增強(qiáng)3D蛋白的穩(wěn)定性，進(jìn)而促進(jìn)CVB3的復(fù)制。本研究的發(fā)現(xiàn)不僅揭示了CVB3致病機(jī)制中的新環(huán)節(jié)，同時表明靶向擬素化修飾過程可能成為抗CVB3感染的潛在治療策略。

原文DOI： 10.1128/jvi.01535-25

本期編輯：小黃