藥學1區5.4分: 上海中醫藥大學等以多組學揭示復元醒腦湯治療腦梗死的作用機制

本期推薦的是由上海中醫藥大學龍華醫院急診科、上海中醫藥大學急危重癥研究所、浙江中醫藥大學第二附屬醫院急診科、浙江中醫藥大學第一附屬醫院重癥監護室、天津中醫藥大學等研究團隊合作近期發表于Journal of ethnopharmacology(IF5.4）的一篇文章，多組學揭示復元醒腦湯通過腸道菌群和JAK2 - STAT3通路治療腦梗死的作用機制。

【期刊簡介】

【題目及作者信息】

Multi-omics Reveals Fuyuan Xingnao Decoction's Therapeutic Mechanism in Cerebral Infararction via Gut Microbiota and JAK2-STAT3 Pathway

民族藥理學相關性

腦梗死是一種腦血管疾病，其特征是血管閉塞導致腦組織缺血缺氧性壞死，繼而引發神經功能缺損。復元醒腦湯（FYXN）是上海中醫藥大學附屬龍華醫院傳統用于防治腦梗死的方劑，但其對大腦的靶向干預機制尚未完全闡明。

目的

本研究旨在探討FYXN對缺血性腦卒中的治療作用及其潛在機制，重點分析其對JAK2-STAT3信號通路的調控作用及對腦微血管內皮細胞活性的影響。

方法

本研究采用代謝組學、網絡藥理學、轉錄組學和蛋白質組學技術，探索FYXN治療缺血性腦梗死的有效成分、潛在靶點和通路。通過16S rRNA測序分析缺血性腦梗死大鼠腸道菌群，并定量短鏈脂肪酸水平。采用TTC、H&E、尼氏（Nissl）和盧克索固藍（髓鞘染色）染色評估腦組織病理變化。通過蛋白質印跡法和免疫組化驗證腦梗死后JAK2-STAT3通路蛋白表達。采用CCK8法驗證FYXN對大鼠和人腦微血管內皮細胞增殖活性的影響。

結果

FYXN中黃酮類化合物含量最高（24.09%），其次為萜類（12.8%）、苯丙素類（12.5%）和氨基酸類（11.28%）。網絡藥理學分析顯示FYXN與腦梗死存在131個共同作用靶點。動物實驗表明，FYXN顯著減小MCAO模型大鼠梗死面積（p < 0.05），改善Zea Longa評分（p < 0.05），增強肢體抓握力。病理染色顯示其改善神經元損傷，并顯著增加尼氏體密度（P < 0.05）。與假手術組相比，MCAO組腸道菌群豐富度和多樣性指數顯著降低（p < 0.05，Cohen's d > 0.8）。丁酸鹽水平與神經元損傷呈顯著負相關（R = -0.6，p = 0.041），且丁酸鹽可降低Zea Longa神經功能評分（p < 0.05，Cohen's d > 0.8），提高大鼠肢體抓握力（p < 0.01），未觀察到明顯脫髓鞘現象，此趨勢與尼莫地平一致。轉錄組學、蛋白質組學和蛋白質-蛋白質相互作用網絡分析預測FYXN具有JAK2、STAT3、EGFR等治療腦梗死的關鍵靶點。大鼠腦組織蛋白檢測顯示，與MCAO組相比，FYXN低、高劑量組均顯著上調JAK2（倍數變化>2）、p-STAT3（倍數變化>2）和VEGF（倍數變化>2）表達，同時降低caspase-3表達水平。體外CCK8實驗證實FYXN顯著促進大鼠和人腦微血管內皮細胞增殖（p < 0.01）。

結論

FYXN治療可能通過調節腸道脂肪酸代謝和潛在激活JAK2-STAT3通路，改善實驗性腦卒中模型的腦梗死面積和神經功能缺損，為后續臨床研究提供理論科學依據。

圖文摘要

【前言】

缺血性腦梗死是一種由血栓阻塞腦血管引起的疾病，導致腦組織缺血缺氧，繼而誘發神經元損傷和功能障礙。目前，缺血性腦卒中的治療主要側重于恢復缺血半暗帶的血流。溶栓和取栓治療已被證明可通過重建缺血區域血流來改善患者預后。然而，根據Marko等人 (2020) 的研究，在隊列人群中溶栓治療的頻率有限，預計到2025年僅增長24%。有限的治療時間窗意味著缺血性腦卒中的發病率和致殘率仍然很高，給臨床醫生、社會及家庭帶來了沉重負擔。因此，尋找預防和治療缺血性腦卒中的有效藥物是一個具有重要意義且至關重要的醫學研究課題。

血管生成和血流增加已被證明是促進缺血性腦卒中恢復過程的有利條件。腦血管細胞的增殖和側支循環的重建在一定程度上決定了神經元的再生與凋亡 。血管生成過程受多種因素復雜相互作用的調控，包括各種生長因子（如IL-6、IL-10、胰島素樣生長因子和VEGF）以及晝夜節律 。鑒于這種復雜性，我們如何才能找到能夠調控血管細胞增殖的有效物質？近年來，中醫藥（TCM）在缺血性腦卒中治療領域引起了廣泛關注。無論是中藥復方 還是單味藥成分均被證明可以促進血管生成并改善缺血性腦卒中的結局。研究表明，JAK2-STAT3通路在腦微血管內皮細胞中能有效治療腦缺血性疾病。

新出現的證據表明，調控腸道菌群及其代謝物可在缺血性腦卒中的治療中發揮作用 。因此，探索與腸道菌群相關的新靶點和新策略以提高缺血性腦卒中的療效和患者預后至關重要。腸道菌群通過腸-腦軸與中樞神經系統進行雙向通信 。短鏈脂肪酸（SCFAs）是腸道細菌發酵膳食纖維產生的主要代謝產物，可能作為以微生物群為靶點的干預措施的潛在介質，用以調節大腦情緒和認知功能。然而，鑒于腸道菌群的復雜性和動態性，需要進一步研究以闡明靶向腸道菌群及其代謝物治療缺血性腦卒中的益處。

根據中醫理論，在正氣（氣）虛弱的基礎上，體內病理產物（痰和瘀血）積聚，導致痰瘀互結。氣虛導致推動血液運行的動力不足，最終表現為中風。在復元醒腦湯（FYXN Decoction）方中，人參（Panax ginseng C.A.Mey）可大補元氣。天南星（Arisaema erubescens (Wall) Schott）、石菖蒲（Acorus tatarinowii Schott）、水蛭（Whitmania pigra Whitman）、三七（Panax notoginseng (Burk) F.H. Chen）、益母草（Leonurus japonicus Houtt）善于祛瘀化痰、活血通竅。制大黃（Rheum palmatum L）具有強大的抗炎活性并能恢復腸道穩態，從而通過菌群-腸-腦軸對缺血性腦卒中發揮治療作用 。這些草藥配伍使用可以補益五臟之氣，祛除瘀血，確保氣血暢通，從而防治中風。在我們先前的研究中，我們報道了FYXN傳統上用于“祛瘀生新” ，并探討了FYXN改善缺血性腦卒中的治療機制。我們前期的研究表明FYXN可以促進VEGF水平；然而，對于JAK2-STAT3通路仍需更多證據。但我們研究的新穎之處在于，我們能否從多角度進一步闡明藥物、靶點與通路之間的相互作用。例如，通過整合轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學等多組學數據，我們旨在闡明FYXN的潛在作用機制，識別潛在靶點和生物標志物，并為治療干預提供精確證據。這將為未來的臨床研究奠定理論基礎。

在本研究中，我們假設FYXN通過調節腸道菌群衍生的SCFAs和激活JAK2-STAT3通路來改善腦梗死（CI）。為驗證這一假設，我們首先采用UPLC-MS/MS技術鑒定了FYXN的成分及含藥血清的代謝成分。采用網絡藥理學將藥物成分的作用靶點與疾病作用靶點相結合，從而預測關鍵分子靶點。在體內部分，通過線栓法阻塞大鼠大腦中動脈制作腦梗死模型。結合RNA-seq轉錄組學和DIA蛋白質組學，預測FYXN治療后腦組織中的關鍵通路靶點。評估腦缺血大鼠的神經功能評分和肢體抓握力喪失情況。對腦組織切片進行TTC和H&E染色，觀察大鼠M1皮層和海馬CA1區的神經元。采用尼氏（Nissl）染色觀察尼氏體，并對胼胝體進行髓鞘染色以評估腦梗死模型的病理變化。采用蛋白質印跡法（Western blotting）和免疫組織化學法檢測通路中關鍵蛋白的表達。檢測了大鼠腸道菌群群落及其代謝物，并利用16S rRNA測序和GC-MS技術研究了丁酸鈉對MCAO模型大鼠的功能改善作用。在體外部分，我們使用FYXN研究其對人和大鼠腦微血管內皮細胞的影響，闡明其對該細胞增殖的作用。

【結果部分】

1.FYXN的體外物質基礎與體內代謝成分。

圖1. FYXN的體外物質基礎與體內代謝成分。（A-B）FYXN在正離子模式和負離子模式下的總離子流色譜圖。（C）FYXN化合物成分鑒定結果。（D）佛手柑內酯（Bergapten）。（E）三甲基甘氨酸（Trimethylglycine）。（F）α-亞麻酸（α-linolenic acid）。（G）Mesifurane。（H）2-己烯醛（2-hexenal）。（I-J）FYXN含藥代謝血清在正離子模式和負離子模式下的總離子流色譜圖。（K）FYXN含藥代謝血清化合物成分鑒定結果。

2.FYXN在CI治療中的潛在組成部分和靶點。

圖2. 網絡藥理學分析法用于研究FYXN在治療CI中的作用。（A）在Genecards、OMIM、PharmGKB和DisGeNet數據庫中CI的目標基因。（B）CI和FYXN目標基因的交集。（C）草藥-成分-靶點網絡。（D）蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡。（E）FYXN治療CI的樞紐基因。（F）對20個樞紐基因的KEGG分析。

3.FYXN對MCAO大鼠具有保護作用，并促進大鼠和人腦微血管內皮細胞的增殖。

圖3. FYXN能有效減少MCAO大鼠的梗死和神經功能缺損。（A）MCAO模型。（B）動物實驗。（C）腦梗死24小時后的TTC染色。（D）腦梗死面積的定量分析（n=3）。（E）Zea Longa神經功能評分（n=4）。（F）MCAO建模前和24小時后大鼠握力測量的差異（n=6）。（G、J）每孔2500、5000、10000和20000個細胞時RBMECs/HBMECs的增殖能力（n=6）；（H、K）不同時間點的RBMECs（n=6）/HBMECs（n=5）；（I、L）OGD/R后的RBMECs/HBMECs（n=5）。與MCAO組相比，*P<0.05，**P<0.01；與假手術組相比，#<0.01。

4.FYXN對MCAO大鼠腦組織病理學的影響。

圖4. FYXN可緩解MCAO大鼠的病理狀況。（A）大鼠皮層（M1區域）的代表性蘇木精-伊紅（HE）染色顯微照片（比例尺=50微米）。（B）大鼠海馬（CA1區域）的HE染色（比例尺=50微米）。黑箭頭指向受損的神經元細胞。（C）大鼠皮層的尼氏（Nissl）染色（比例尺=100微米）。（D）大鼠海馬的尼氏染色（比例尺=50微米）。（E）皮層中神經元數量的定量分析（n=3）。（F）海馬中神經元的數量（n=3）。

5.FYXN調節了MCAO大鼠中mRNA的表達。

圖5. 通過RNA測序分析MCAO大鼠中的差異表達基因（DEGs）和信號通路。（A）各組的基因密度圖（log2Counts）和樣本相關性分析。（B）MCAO與假手術組以及FYXN與MCAO組的差異表達基因（DEGs）的火山圖（P-adjust<0.05，Fold change=2）。（C）兩組中差異表達基因的分布（在維恩圖中，P-adjust<0.05）和逆轉的差異表達基因（在柱狀圖中，P-adjust<0.05）。（D）MCAO大鼠中與JAK-STAT信號通路相關的基因的熱圖。（E）JAK-STAT信號通路被分為三個框：左側（假手術），中間（MCAO），右側（FYXN）。顏色的深淺隨基因表達量的增加而加深。

6.FYXN調節了MCAO大鼠中蛋白質的表達。

圖6. MCAO大鼠中差異表達蛋白（DEPs）和顯著通路的蛋白質組學實驗結果。（A）假手術組、MCAO組和FYXN組的PLS-DA圖。（B）MCAO與假手術組以及FYXN與MCAO組的差異表達蛋白（DEPs）的火山圖（P<0.05，Fold change=1.5）。（C）兩組中差異表達蛋白的分布（在維恩圖中，P<0.05）和逆轉的差異表達蛋白（在柱狀圖中，P<0.01）。（D）MCAO大鼠中與JAK-STAT信號通路相關的蛋白的熱圖。（E）JAK-STAT信號通路被分為三個框：左側（假手術），中間（MCAO），右側（FYXN）。顏色的加深表示蛋白表達量的增加。

7.JAK2-STAT3激活的Western blot分析。

圖7. FYXN在腦梗死24小時后對Jak2、p-STAT3、STAT3、IL6、VEGF、NF-κB、Caspase-3和AMPK蛋白表達水平的影響。（A）Jak2/β-actin的相對蛋白水平；（B）p-STAT3/β-actin的相對蛋白水平；（C）STAT3/β-actin的相對蛋白水平；（D）IL6/β-actin的相對蛋白水平；（E）VEGF/β-actin的相對蛋白水平；（F）NF-κB/β-actin的相對蛋白水平；（G）Caspase-3/β-actin的相對蛋白水平；（H）AMPK/β-actin的相對蛋白水平。（均值±標準差；n=3；*P<0.05，**P<0.01）。（I）大鼠腦組織中STAT3和VEGF的典型免疫組化照片。

8.FYXN對MCAO大鼠腸道菌群組成的影響。

圖8. FYXN誘導的大鼠腸道微生物群變化。（A–B）Chao1和ACE指數反映腸道菌群的豐富度（n=4）。（C–D）Shannon和Simpson指數反映腸道菌群的多樣性（n=4）。（E）基于主坐標分析（PCoA）和（F）相似性分析（ANOSIM）評估β多樣性。（G）線性判別分析效應大小（LEfSe）。（H）各組間顯著豐度差異的生物標志物（LDA值>4）。柱狀圖的長度代表生物標志物物種的貢獻。（I）在綱、種、屬、門、目和科水平上的腸道菌群變化。

9.FYXN通過改善腸道菌群產生的短鏈脂肪酸（SCFA）和丁酸鹽介導的神經功能恢復。

圖9. FYXN干預后及丁酸鹽介導的MCAO大鼠短鏈脂肪酸（SCFA）含量檢測。（A）短鏈脂肪酸的熱圖。（B）PCA模型的得分圖。（C）PLS-DA載荷圖模型。（D）糞便中丁酸、丙酸、戊酸和異戊酸濃度的定量結果。（E）Zea Longa評分與短鏈脂肪酸含量的Spearman相關性分析。（F）丁酸對MCAO大鼠的動物實驗設計。（G）大鼠神經功能評分的Zea Longa統計結果。（與MCAO組相比，*P<0.05；與假手術組相比，#<0.01，n=4）。（H）MCAO建模前和24小時后大鼠的握力測量（n=3）。（I）胼胝體的LFB染色切片的代表性圖像（比例尺=100微米）。

【結論與討論】

在這項研究中，揭示了FYXN通過調節JAK2-STAT3信號通路，促進VEGF表達和血管生成，從而改善MCAO大鼠的神經功能缺損。此外，FYXN還通過調節腸道菌群產生的短鏈脂肪酸（SCFA），特別是丁酸鹽，間接促進神經功能恢復。然而，研究存在局限性：未通過基因敲除或藥理抑制等方法直接驗證FYXN對JAK2-STAT3通路的作用，且未評估FYXN對全身代謝（如肝腎功能）的潛在影響，這些影響可能間接調節觀察到的結果。未來研究需進一步驗證FYXN的作用機制，并深入探討其對全身代謝的潛在影響。

注：本文原創表明為原創編譯，非聲張版權，侵刪！

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