成功解決六十年謎團！新加坡國立大學團隊發表Nature 子刊！

革蘭氏陰性細菌（Gram?negative bacteria）如大腸桿菌、銅綠假單胞菌、沙門氏菌等，表面包裹著一層額外的外膜（outer membrane, OM），這個雙層脂質結構不僅能抵御多數抗生素，還能阻擋人體自然免疫的溶菌酶，為致病和耐藥提供堅實“鎧甲”。這層“外膜”為何穩定？它的維護機制為何幾十年來成謎？

2025年7月2日，新加坡國立大學團隊登上《Nature Communications》，揭示了這一古老謎團，確定了負責維持外膜 (OM) 穩定性的重要蛋白質復合物的主要功能。該研究題為“Primary role of the Tol-Pal complex in bacterial outer membrane lipid homeostasis”。

研究背景

革蘭氏陰性菌由外膜 (OM) 定義，OM 有助于包膜完整性和屏障功能。構建此雙層膜需要脂多糖、蛋白質和磷脂的正確組裝，但這些成分的平衡如何實現尚不清楚。Tol-Pal 復合物是一個長期已知的確保 OM 穩定性的系統，它與維持 OM 脂質穩態有關。然而，由于 Tol-Pal 的隔膜定位及其在分裂過程中的相關作用，其功能分配一直具有挑戰性。

在這篇研究，作者通過設計一個失去隔膜富集的嵌合復合物，將Tol-Pal 在 OM 脂質穩態中的作用與其對大腸桿菌細胞分裂的影響分離開來。證明這種位于外周的 Tol-Pal 復合物完全能夠維持 OM 中的脂質平衡，從而恢復 OM 的完整性和屏障。這項工作確定了 Tol-Pal 復合物在 OM 脂質穩態中的主要功能，與其在分裂過程中的作用無關。

實驗方法

巧妙脫鉤，突出脂質功能

為明確 Tol–Pal在膜脂質調控方面的獨立角色，研究人員采用以下方法進行了研究：

l基因工程構建：將 Tol–Pal 中段插入 TonB TM 片段，制造一個失去分裂誘導定位但保留脂質功能的嵌合體；

l功能驗證：采用核糖體標簽與免疫熒光技術驗證嵌合體是否仍分布于膜邊緣；

l脂質穩態檢測：通過放射性同位素標記磷脂（PG/CL）測定外膜中PL 含量，評估遺漏后的積累程度；

l通透性評估：SDS/EDTA敏感實驗、OMV（外膜囊泡）釋放量檢測、RNAse I外漏實驗等評估膜完整性；

l對比評價：將具有 TonB-TolA 嵌合體菌株與 Δtol-pal（完整缺失）和野生型進行多重表型比較。

不僅如此，作者綜合上文細菌膜系統研究文獻，如Tol–Pal調控外膜 LPS/PL 結構平衡的早期理論以及 OM 穩固多機制協同關系，構建了一整套驗證系統。

實驗結果

脫鉤后仍能穩膜，證真脂質核心功能

研究人員首先通過構建一個TonBTM-TolA 嵌合蛋白，揭示 TolA 在維持細菌外膜完整性方面的功能可以脫離細胞分裂定位而獨立實現。

研究者將 TolA 的膜穿越區替換為 TonB 的跨膜螺旋，使其能夠與 ExbBD 復合物而非 TolQR 互作。由于 ExbBD-TonB 復合體不會定位到分裂位點，這一設計使嵌合體失去分裂相關定位功能，但仍可能保留 TolA 在膜脂穩定中的作用。在大腸桿菌 ?tolQRA 缺失菌株中表達 TonBTM-TolA 后，菌株對 SDS/EDTA 和萬古霉素的耐受性顯著增強，表明其外膜屏障功能完全恢復。相比之下，僅表達野生型 TolA 的恢復效果較差。這些結果明確指出：TolA 的膜穩態作用可獨立于其分裂定位功能，并依賴其與 ExbBD 的有效互作，揭示 Tol-Pal 復合體在細菌外膜脂質穩態中的核心作用。

研究發現，TonBTM-TolA 嵌合蛋白無法定位至細胞分裂位點，也不能促進 Pal 在中隔富集，因此無法修復 Tol-Pal 缺失導致的分裂缺陷。熒光顯微顯示，sfGFP-TonBTM-TolA 在細胞膜周圍均勻分布，而非聚集于中隔。Pal-mCherry在 ?tolQR 背景中未能恢復中隔定位，進一步證實 TolA的分裂功能依賴其定位特性。盡管如此，TonBTM-TolA 能完全恢復外膜屏障功能，并糾正 tol-pal 缺失導致的細胞形態異常，提示該嵌合體在周邊定位即可維持外膜脂穩態。

此外，研究表明，雖然 ExbBD-TonBTM-TolA 嵌合體失去中隔定位能力，但其仍能恢復 Tol-Pal 缺失菌株的外膜脂穩態功能。該嵌合體顯著減少外膜囊泡（OMVs）釋放量約79%，并有效降低異常升高的磷脂/脂多糖（PL:LPS）比例與 hepta-acylated LPS 水平，恢復至接近野生型。說明 Tol-Pal 的主要功能是維持外膜脂穩態與結構穩定，而非依賴中隔定位。該發現有助于明確 Tol-Pal 的功能核心，也為今后操控外膜穩態提供了潛在策略。

總結

本研究明確Tol-Pal維持外膜脂穩態的功能可獨立于其細胞分裂作用，揭示其主要生理職責在于調控外膜脂質組成與穩定性。未來應聚焦于Tol-Pal是否通過驅動磷脂回收實現脂穩態，并探索其在細胞分裂中調控膜曲率與內陷的潛在機制。

專家表明，這一突破標志著我們對細菌外膜組裝和脂質運輸的整體理解取得了重要的概念進步，也證明了我們為闡明活細胞基本機制所做的持續努力。

https://www.nature.com/articles/s41467-025-57630-y#Sec2

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