Vita | 中科院上海有機所袁鈞瑛/單冰團隊揭示壞死終末事件中的蛋白切割機制

細胞死亡是生命體維持穩態的重要過程。細胞凋亡（apoptosis）和壞死（necrosis）是兩種形態和機制截然不同的死亡方式。凋亡由caspase蛋白酶介導，過程中細胞膜保持完整，細胞內容物被有序包裹在凋亡小體中，通過“胞葬作用”被清除，不會引發炎癥反應。而壞死則以早期細胞膜完整性喪失為特征，內容物泄漏，往往誘發炎癥和自身免疫病理。然而，與凋亡中caspase介導的廣泛蛋白切割已被清晰認知不同，壞死終末階段是否發生類似的系統性蛋白水解事件，長期以來我們知之甚少。

2026年4月7日，中國科學院上海有機化學研究所生物與化學交叉研究中心袁鈞瑛院士和單冰研究員團隊在《Vita》期刊發表了題為“Distinct necrotic protein cleavages define terminal events in necrosis”的研究論文。該研究系統揭示了壞死細胞在質膜破裂后，胞外胰蛋白酶樣蛋白酶侵入細胞內，對大量蛋白底物進行特異性切割，這一過程驅動核結構重塑、染色質DNA降解，并促進壞死細胞殘骸的吞噬清除，從而限制自身免疫病理。

研究團隊首先利用三維光學衍射斷層掃描技術對活細胞進行無標記成像，發現壞死細胞（包括壞死性凋亡和鐵死亡）的核膜和核仁在早期即變得彌散，折射率顯著下降；而凋亡細胞則形成典型的凋亡小體，核膜相對完整。免疫熒光染色進一步顯示，壞死細胞中核纖層蛋白Lamin-B1信號特異性喪失，但核孔復合物蛋白Nup98信號仍保留；凋亡細胞則表現為核膜變形但兩者信號均存在。值得注意的是，在誘導焦亡的LPS/Nigericin處理中，單個細胞呈現出兩種不同的死亡形態：部分細胞表現為凋亡樣，部分表現為壞死樣，揭示了焦亡執行方式的異質性。

通過蛋白質免疫印跡分析，研究團隊發現壞死細胞中Lamin-B1和Lamin-A/C產生與凋亡截然不同的切割產物：壞死產生約50 kDa和55 kDa的較大片段，而凋亡產生約40 kDa和30 kDa的較小片段。這些壞死特異性切割可被RIPK1、RIPK3、MLKL抑制劑或鐵死亡抑制劑Liproxstatin-1所阻斷，并在小鼠腎缺血再灌注損傷模型中同樣被觀察到，提示該現象具有體內病理生理相關性。

利用SYTOX Green標記喪失質膜完整性的細胞并進行流式分選，研究者發現壞死性Lamin-B1切割僅發生在SYTOX Green陽性細胞中，而磷酸化MLKL在陰性和陽性細胞中均可檢測到。這一關鍵結果表明：壞死性蛋白切割發生在質膜破裂之后，是細胞死亡執行終末階段的事件。進一步研究發現，這一切割可被廣譜蛋白酶抑制劑leupeptin有效抑制，且依賴于培養基中胎牛血清或新鮮小鼠血清中的蛋白酶，提示胞外蛋白酶在質膜破裂后侵入細胞介導了這些切割事件。

為了系統鑒定壞死中的蛋白切割底物，團隊開展了neo-N端組學分析。在壞死性凋亡的HT29細胞、BMDMs以及小鼠腎缺血再灌注損傷模型中，他們鑒定出大量以精氨酸/賴氨酸殘基后切割為特征的neo-N端肽段。其中在BMDMs和AKI模型中共有的切割肽段達1253條，源自772個蛋白，切割位點同樣高度富集于精氨酸/賴氨酸之后。這些特征與胰蛋白酶樣蛋白酶的切割特異性高度一致，且可被leupeptin抑制。通過質譜鑒定和功能互補實驗，PRSS家族胰蛋白酶和纖溶酶原被證實可介導這些壞死性蛋白切割。

研究進一步發現，leupeptin抑制這些切割事件后，可顯著減輕壞死細胞中基因組DNA的降解，保護核膜和核仁結構的完整性。在吞噬實驗中，抑制壞死性切割會減少巨噬細胞對壞死細胞核組分的吞噬，但對胞質成分的攝取無影響。將經leupeptin處理的壞死細胞注射到小鼠腹腔后，可導致脾腫大和血清自身抗體水平升高，表明壞死性蛋白切割在促進壞死細胞清除、防止自身免疫中發揮重要作用。

最后，研究團隊針對ABHD16A（切割于R178之后）和GLUD1（切割于K397之后）開發了特異性識別壞死切割產物的單克隆抗體。這些抗體能夠在小鼠腎缺血再灌注損傷、肝缺血再灌注損傷、腸道炎癥模型以及人糖尿病腎病樣本中特異性地標記壞死細胞，為在組織和疾病背景下評估壞死終末事件提供了重要的研究工具。

論文的通訊作者是中國科學院上海有機化學研究所生物與化學交叉研究中心主任袁鈞瑛院士和單冰副研究員。第一作者是中國科學院上海有機化學研究所生物與化學交叉研究中心李甘泉博士。中國科學院上海有機化學研究所生物與化學交叉研究中心張耀陽研究員給N端標記蛋白質譜分析提供寶貴建議，北京大學陳良怡研究員對超分辨率ODT顯微成像技術的使用提供了寶貴幫助，上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院李佩盈研究員提供了寶貴的病人樣本。

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